新型亞微米親水作用色譜的制備及其在加壓毛細(xì)管電色譜中的應(yīng)用

胡 靜,劉讓東,王薇薇,王 彥,閆 超

(上海交通大學(xué)藥學(xué)院, 上海 200240)

近些年來,隨著生物醫(yī)藥技術(shù)、食品安全和環(huán)境監(jiān)測等研究領(lǐng)域的發(fā)展,強(qiáng)極性和親水性小分子物質(zhì)迅速成為藥物、食品分析和生物化學(xué)等領(lǐng)域的重要研究對象。反相液相色譜(reversed-phase liquid chromatography, RPLC)作為一種色譜分析技術(shù),被廣泛應(yīng)用于弱極性及中等極性化合物的分離分析,但強(qiáng)極性和親水性化合物在RPLC上保留很弱,導(dǎo)致分離困難。

1990年,美國科學(xué)家Alpert[1]首次提出了親水作用色譜(hydrophilic-interaction chromatography, HILIC)的概念,在此后的二十多年時(shí)間里,HILIC迅速發(fā)展,為分離強(qiáng)極性和親水性化合物提供技術(shù)支持[2],在代謝組學(xué)[3]、藥物分析[4,5]、食品分析[6]、中藥現(xiàn)代化[7,8]、環(huán)境保護(hù)[9,10]等研究領(lǐng)域呈現(xiàn)出獨(dú)特的優(yōu)越性和極強(qiáng)潛力。

新型親水作用固定相是親水色譜領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)之一,離子型固定相表面可與不同性質(zhì)的帶電基團(tuán)進(jìn)行結(jié)合[11],具有很好的親水作用。比如半胱氨酸是一種天然的兩性離子化合物,Shen等[12]將其作為功能基團(tuán)修飾在5 μm二氧化硅微球表面,在低聚糖、多肽及堿性化合物的分離中,表現(xiàn)出良好的分離選擇性。

根據(jù)van Deemter方程,降低填料粒徑大小能獲得更好的分離柱效,但同時(shí)會(huì)帶來反壓過高的問題。加壓毛細(xì)管電色譜(pressurized capillary electrochromatography, pCEC)擁有HPLC和CE的雙重機(jī)理,采用壓力流和電滲流同時(shí)推動(dòng)樣品和流動(dòng)相[13],能夠有效解決上述問題。本實(shí)驗(yàn)采用改良St?ber法合成580 nm粒徑大小的二氧化硅亞微米填料,通過“巰基-烯”點(diǎn)擊化學(xué)將L-半胱氨酸修飾在其表面,制備新型的亞微米親水色譜填料,并以pCEC為平臺(tái),實(shí)現(xiàn)對核苷、酚類、胺類及多肽等極性化合物的分離,為極性及親水性化合物的分離分析提供新的解決思路。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器與試劑材料

TriSepTM-3000加壓毛細(xì)管電色譜儀(美國Unimicro Technologies公司),包括溶劑輸送系統(tǒng)、微流控系統(tǒng)、高壓電源、柱上紫外檢測器和數(shù)據(jù)采集系統(tǒng);Vario EL Cube元素分析儀(德國Elementar公司); S-4800場發(fā)射掃描電鏡(日本電子株式會(huì)社); SHB-Ⅲ循環(huán)水式多用真空泵(鄭州長城科工貿(mào)有限公司); DF-101S集熱式恒溫加熱磁力攪拌器(鞏義市予華儀器有限責(zé)任公司); KQ5200DE超聲波清洗儀(昆山市超聲儀器有限公司); DM36-12馬弗爐(上海德恭實(shí)業(yè)有限公司); JD200-3電子天平(鄭州南北儀器有限公司); TGL-16G高速離心機(jī)(上海安亭科學(xué)儀器廠); XW-80A渦旋混合器(上海青浦滬西儀器廠); Molcell 1805V摩爾細(xì)胞型純水儀(重慶摩爾水處理設(shè)備有限公司)。

正硅酸四乙酯(tetraethylorthosilicate, TEOS)、甲苯、無水乙醇、氨水、吡啶、甲醇、丙烯酰胺、硫脲、苯酚、鄰苯二酚、間苯三酚、對甲苯胺和N,N′-二甲基雙丙烯酰胺均為分析純(國藥集團(tuán)化學(xué)試劑公司);丙酮(分析純,上海凌峰化學(xué)試劑有限公司);偶氮二異丁腈(azobisisobutyronitrile, AIBN,純度99%,上海試四赫維化工有限公司);乙腈(色譜純,Tedia公司);乙烯基三氯硅烷(vinyltrichlorosilane, VTMS,純度98%)、L-半胱氨酸(純度99%)、尿嘧啶(純度98%)、胞嘧啶(純度99%)、尿苷(純度99%)、肌苷(純度99%)、胞苷(純度99%)和鳥苷(純度99%)(北京百靈威科技有限公司);精氨酸加壓素(純度99%)、催產(chǎn)素(純度98%)和Met-enkephalin肽(純度98%)(生工生物工程(上海)股份有限公司);石英毛細(xì)管(100 μm i. d.,永年縣銳灃色譜器件有限公司)。

1.2 亞微米單分散的二氧化硅微球的合成

580 nm亞微米單分散二氧化硅微球的合成:以文獻(xiàn)[14]方法為基礎(chǔ),本試驗(yàn)的具體合成過程為:配置15 mL 28%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))的濃氨水、24.75 mL超純水和一定體積無水乙醇的混合溶液,加入圓底燒瓶中,混合均勻,置于油浴鍋控溫?cái)嚢?配置10 mL正硅酸四乙酯和無水乙醇的混合溶液,快速加入圓底燒瓶,高速攪拌1 min后降低攪拌速度,封口反應(yīng)2 h。反應(yīng)完畢后將反應(yīng)液轉(zhuǎn)移至燒杯中,用濃鹽酸調(diào)pH至中性,超純水浮選多次至超純水層無明顯懸浮顆粒為止。洗滌抽濾,于65 ℃烘箱中干燥過夜,馬弗爐中煅燒3次,備用。

1.3 半胱氨酸功能基團(tuán)的修飾

將經(jīng)濃硝酸活化的580 nm亞微米二氧化硅微球混懸于無水甲苯中,依次加入VTMS、吡啶,常溫下磁力攪拌反應(yīng)12 h,反應(yīng)結(jié)束后依次用乙醇、丙酮洗滌,抽濾,干燥,得到反應(yīng)產(chǎn)物VTMS-SiO2。將適量VTMS-SiO2混懸于甲醇-水溶液中,加入半胱氨酸、AIBN,于65 ℃下反應(yīng)24 h,反應(yīng)結(jié)束后抽濾并依次用超純水和甲醇清洗,得到反應(yīng)產(chǎn)物Cys-VTMS-SiO2。

1.4 毛細(xì)管色譜柱的制備

截取一定長度100 μm內(nèi)徑的毛細(xì)管,活化,氮?dú)獯蹈蓚溆?。采用高壓勻漿法將水混懸的新型580 nm亞微米固定相Cys-VTMS-SiO2裝入毛細(xì)管中,填充至所需有效長度,燒結(jié)柱塞和窗口,備用。

表 1 溫度、攪拌速度和反應(yīng)時(shí)間對微球粒徑大小的影響

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2 結(jié)果與討論

2.1 亞微米二氧化硅微球的制備與表征

2.1.1亞微米二氧化硅微球的合成優(yōu)化

St?ber等[15]采用正硅酸四乙酯為原料合成硅顆粒,本實(shí)驗(yàn)室[14,16]通過一系列的條件優(yōu)化,合成出了單分散亞微米二氧化硅微球。本實(shí)驗(yàn)將進(jìn)一步優(yōu)化實(shí)驗(yàn)方法,考察反應(yīng)溫度、攪拌速度和反應(yīng)時(shí)間對合成結(jié)果的影響。其中,反應(yīng)溫度和攪拌速度對粒徑大小影響顯著(見表1)。反應(yīng)1～6考察了反應(yīng)溫度對粒徑大小的影響,反應(yīng)溫度低于20 ℃會(huì)產(chǎn)生團(tuán)聚現(xiàn)象,在26 ℃后微球粒徑大小隨著溫度的升高而逐漸降低。反應(yīng)7～10考察了攪拌速度對粒徑大小的影響,攪拌速度過快或過慢均不利于微球的生長,在650 r/min時(shí)粒徑大小可達(dá)到(577±6) nm。反應(yīng)11～13考察了反應(yīng)時(shí)間對粒徑大小的影響,結(jié)果表明,當(dāng)微球生長到一定大小后反應(yīng)時(shí)間不會(huì)對粒徑產(chǎn)生顯著影響。

在反應(yīng)溫度為26 ℃,攪拌速度為650 r/min,反應(yīng)時(shí)間為2 h的條件下,合成580 nm亞微米二氧化硅微球,掃描電鏡(SEM)圖如圖1所示,顯示合成的微球表面光滑、粒徑均勻且單分散。

圖 1 580 nm亞微米二氧化硅微球的電鏡掃描圖Fig. 1 Scanning electron microscopy (SEM) imageof the 580 nm submicron SiO2particles

2.1.2亞微米二氧化硅微球的表面修飾與表征

進(jìn)一步通過“巰基-烯”點(diǎn)擊化學(xué)將半胱氨酸鍵合到亞微米二氧化硅微球表面,形成新型親水作用色譜固定相,修飾路徑見圖2。

圖 2 580 nm亞微米二氧化硅微球的L-半胱氨酸修飾的合成Fig. 2 Synthesis of L-cysteine modified580 nm submicron SiO2particles VTMS: vinyltrichlorosilane; AIBN: azobisisobutyronitrile.

采用元素分析法測定中間產(chǎn)物VTMS-SiO2和最后產(chǎn)物Cys-VTMS-SiO2的含碳量分別為0.35%和7.93%,說明半胱氨酸功能基團(tuán)被成功鍵合到了微球表面。根據(jù)圖3可知,該Cys-VTMS-SiO2微球的比表面積為8.383 m2/g,孔徑為3.055 nm,總孔容積為0.023 m3/g。根據(jù)比表面積數(shù)據(jù)和元素分析結(jié)果計(jì)算得到該二氧化硅微球的碳載樣量為157.66 μmol/m2。

圖 3 580 nm亞微米Cys-VTMS-SiO2的(a) N2吸附-解吸附圖和(b)孔徑分布圖Fig. 3 (a) N2adsorption-desorption isotherm plot and (b) pore size distribution curve of the 580 nm submicron Cys-VTMS-SiO2

利用傅里葉紅外儀對半胱氨酸修飾后的Cys-VTMS-SiO2微球進(jìn)行表征,結(jié)果見圖4。同純SiO2微球相比,Cys-VTMS-SiO2的紅外譜圖出現(xiàn)很多新吸收峰。其中3 433.56 cm-1處的吸收峰為N-H伸縮振動(dòng),1 585.02 cm-1處的吸收峰為N-H面內(nèi)彎曲振動(dòng),810.07 cm-1處的吸收峰為N-H面外彎曲振動(dòng),1 338.83 cm-1處的吸收峰為C-N伸縮振動(dòng),3 031.41 cm-1處的吸收峰為O-H伸縮振動(dòng),1 297.57 cm-1處的吸收峰為C-O伸縮振動(dòng),1 620.87 cm-1處的吸收峰為C=O伸縮振動(dòng),964.30 cm-1為C-S伸縮振動(dòng),這些吸收峰的存也反映了半胱氨酸功能基團(tuán)的成功修飾。

將修飾好的580 nm亞微米Cys-VTMS-SiO2微球裝入毛細(xì)管色譜柱中,如圖5所示,色譜柱裝填緊密,狀態(tài)良好。

圖 4 580 nm亞微米SiO2和Cys-VTMS-SiO2的傅里葉紅外光譜圖Fig. 4 FT-IR spectra of the 580 nm submicronSiO2and Cys-VTMS-SiO2

圖 5 毛細(xì)管柱的電鏡掃描圖Fig. 5 SEM image of the capillary column

2.2 580 nm亞微米Cys-VTMS-SiO2色譜填料的親水機(jī)理考察

為了考察580 nm亞微米Cys-VTMS-SiO2色譜填料的親水作用分離機(jī)理,選擇丙烯酰胺和硫脲兩種物質(zhì)為分離對象,測定保留時(shí)間與有機(jī)相濃度之間的關(guān)系,結(jié)果見圖6。

在高有機(jī)相條件下(φ(ACN)>93%)下,丙烯酰胺和硫脲的保留呈現(xiàn)親水相互作用的保留機(jī)理,即保留時(shí)間隨有機(jī)相比例增加而增加;另外,這兩個(gè)物質(zhì)在亞微米Cys-VTMS-SiO2色譜柱上的出峰順序也表現(xiàn)為極性小的丙烯酰胺先出峰,極性大的硫脲最后出峰,符合親水色譜的機(jī)理。

2.3 580 nm亞微米Cys-VTMS-SiO2親水色譜柱分離性能的考察

選用甲苯、丙烯酰胺和硫脲為分離對象,以毛細(xì)管液相色譜(cLC)和pCEC兩種分離模式為平臺(tái),對本研究合成的亞微米Cys-VTMS-SiO2親水色譜柱的分離性能進(jìn)行考察。

圖 6 580 nm亞微米Cys-VTMS-SiO2毛細(xì)管填充柱親水作用機(jī)理考察Fig. 6 Investigation of hydrophilic mechanism on the 580 nm submicron Cys-VTMS-SiO2packed capillary column Column: 20 cm (effective length, 45 cm total length)×100 μm i. d.; mobile phase, pH 6.01 ACN/H2O containing 100 mmol/L ammonium formate solution; back pressure, 14.4 MPa; detection wavelength, 254 nm.

2.3.1施加電壓和流速對分離的影響

圖 7 (a)電壓和(b)流速對580 nm亞微米Cys-VTMS-SiO2毛細(xì)管填充柱分離的影響Fig. 7 Effects of (a) voltages and (b) flow rates on the separation of capillary column packed with580 nm submicron Cys-VTMS-SiO2 Column: 20 cm (effective length, 45 cm total length)×100 μm. (a) Mobile phase, ACN-H2O (98∶2, v/v) containing 100 mmol/L ammonium formate, pH 6.01; applied voltage, 0 to -15 kV; back pressure, 14.4 MPa; (b) mobile phase, ACN-H2O (96∶4, v/v) containing 100 mmol/L ammonium formate, pH 6.01; applied voltage, -15 kV; detection wavelength, 254 nm. Peak Nos.: 1. toluene; 2. acrylamide; 3. thiourea.

分別在cLC(0 kV)和pCEC(-5 kV到-20 kV)模式下對3種化合物進(jìn)行分離,結(jié)果(見圖7a)表明,施加電壓能顯著縮短保留時(shí)間,且電壓越大,出峰時(shí)間越快。pCEC模式下,柱塞型電滲流驅(qū)動(dòng)力和拋物線型壓力流驅(qū)動(dòng)力聯(lián)合驅(qū)動(dòng)樣品的分離,大大提高了分離效率[12]。當(dāng)施加電壓達(dá)到-10 kV時(shí),分離度達(dá)到最大值,但電壓繼續(xù)增加到-15 kV時(shí),分離度又逐漸降低,可能是樣品和固定相的作用時(shí)間減少及產(chǎn)生焦耳熱所致,因此最終選擇-10 kV電壓對3種物質(zhì)進(jìn)行分離。

考察了流速對亞微米Cys-VTMS-SiO2親水色譜柱分離性能的影響,結(jié)果(見圖7b)表明,增加流速,分離時(shí)間縮短,分離度變化不大,綜合考慮時(shí)間和分離度,選擇0.08 mL/min為后續(xù)實(shí)驗(yàn)的流速值。

2.3.2緩沖鹽濃度對分離的影響

在不同緩沖鹽濃度條件下,3種物質(zhì)均能達(dá)到基線分離(見圖8a)。隨著緩沖鹽濃度的降低,分離度逐漸增大,但當(dāng)甲酸銨緩沖鹽濃度為5 mmol/L時(shí),硫脲的峰形很寬且有拖尾現(xiàn)象;隨著緩沖鹽濃度的增加,峰形得到明顯改善,達(dá)到100 mmol/L時(shí)峰形最佳,推測除了緩沖液濃度對電流的影響外,本文合成的親水色譜填料表面的半胱氨酸可能具有一定的離子交換作用。

2.3.3緩沖液pH對分離的影響

分別采用pH=3.86、4.50、6.01和9.04的緩沖液分離甲苯、丙烯酰胺和硫脲。結(jié)果表明,3種物質(zhì)在不同pH條件下均能達(dá)到基線分離,但分離度有所變化(見圖8b)。從離子交換機(jī)理推測分離度改變的原因,由于色譜柱表面半胱氨酸的等電點(diǎn)為5.05,當(dāng)pH值較低時(shí)弱陰離子交換的分離機(jī)制發(fā)揮作用;隨著pH逐漸接近等電點(diǎn),分離度逐漸變小(3種物質(zhì)在pH 4.5的分離度小于pH 3.86);當(dāng)pH大于等電點(diǎn)時(shí),隨著pH的增大,分離度不斷增加,保留時(shí)間也逐漸變長,可能是因?yàn)槿蹶栯x子交換的分離機(jī)制開始發(fā)揮作用。

2.3.4日內(nèi)和日間重現(xiàn)性考察

采用甲苯、丙烯酰胺和硫脲為標(biāo)記物,考察毛細(xì)管色譜柱的重現(xiàn)性,日內(nèi)(n=6)保留時(shí)間的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差分別是1.1%、0.8%和1.0%,峰面積的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差分別為2.0%、1.1%和2.0%;日間(n=3)保留時(shí)間的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差分別是1.1%、0.9%和1.0%,峰面積的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差分別為0.5%、2.0%和2.0%。取3個(gè)批次的色譜柱,甲苯、丙烯酰胺和硫脲保留時(shí)間的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差分別是0.8%、0.2%和1.2%,峰面積的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差分別為3.8%、5.0%和2.0%。可見毛細(xì)管親水Cys-VTMS-SiO2色譜柱在pCEC模式下具有良好的重現(xiàn)性,且該色譜柱制備方法重現(xiàn)性好,批次間的差異小,成功率高。

圖 8 (a)緩沖鹽濃度和(b)緩沖鹽pH對580 nm亞微米Cys-VTMS-SiO2毛細(xì)管填充柱分離的影響Fig. 8 Effects of (a) buffer concentrations and (b) buffer pHs on the separation ability ofthe capillary column packed with 580 nm submicron Cys-VTMS-SiO2 Column: 20 cm (effective length, 45 cm total length)×100 μm i. d. Mobile phases: (a) ACN-H2O (98∶2, v/v) containing ammonium formate of 5 to 100 mmol/L, pH 6.01; (b) ACN/H2O (98∶2, v/v) containing 100 mmol/L ammonium formate, pH 3.86 to 9.04. Applied voltage: -10 kV; back pressure: 14.4 MPa; detection wavelength: 254 nm. Peak Nos.: 1. toluene; 2. acrylamide; 3. thiourea.

2.4 新型親水作用毛細(xì)管填充柱的應(yīng)用

通過在pCEC模式下分離核苷類、酚類、胺類和多肽化合物,進(jìn)一步考察新型毛細(xì)管兩性離子毛細(xì)管填充柱在極性化合物分離中的應(yīng)用。

2.4.1核苷類化合物的分離

對尿嘧啶、胞嘧啶、尿苷、肌苷、胞苷和尿苷組成的核苷類混合物進(jìn)行分離,來考察親水色譜柱的性能。圖9a顯示這6種化合物在20 min內(nèi)能被快速有效分離。分離條件為:流動(dòng)相為pH=6.3的乙腈-25 mmol/L甲酸銨(93∶7, v/v)緩沖溶液;施加電壓為-18 kV;壓強(qiáng)為15.2 MPa。

2.4.2酚類化合物的分離

在pCEC模式下對酚類化合物進(jìn)行分離,在11 min內(nèi)實(shí)現(xiàn)了苯酚、鄰苯二酚和間苯三酚的快速分離(見圖9b),且出峰順序與其極性相關(guān),極性越大,保留時(shí)間越長。分離條件為:流動(dòng)相為pH=6.3的乙腈-25 mmol/L甲酸銨(98∶2, v/v)緩沖溶液;施加電壓為-10 kV;壓力為16.3 MPa。

2.4.3胺類化合物的分離

在pCEC模式下對酚類化合物進(jìn)行分離,在12 min內(nèi)實(shí)現(xiàn)了對甲苯胺、N,N′-二甲基雙丙烯酰胺和硫脲的快速分離,出峰順序與化合物極性相關(guān),極性越大,保留時(shí)間越長(見圖9c)。分離條件為:流動(dòng)相為pH=6.3的乙腈-25 mmol/L甲酸銨(98∶2, v/v)緩沖溶液;施加電壓為-10 kV;壓力為15.8 MPa。

2.4.4多肽類化合物的分離

新型親水作用色譜柱在ACN-H2O(40∶60, v/v,含25 mmol/L甲酸銨)流動(dòng)相條件下,實(shí)現(xiàn)了對3種多肽混合物的分離,在pCEC模式下,隨著施加電壓的增大,保留時(shí)間縮短,柱效最高可達(dá)145 000 plates/m,分離圖譜見9d。

圖 9 核苷類、酚類、胺類和多肽類化合物在580 nm亞微米Cys-VTMS-SiO2毛細(xì)管填充柱上的分離Fig. 9 Separation of (a) nucleosides, (b) phenols, (c) amides, and (d) peptides on the column packed with 580 nm submicron Cys-VTMS-SiO2

3 結(jié)論

通過條件優(yōu)化合成不同粒徑的亞微米二氧化硅微球,選擇580 nm亞微米粒徑大小的微球作為基質(zhì),兩步反應(yīng)將兩性離子化合物半胱氨酸修飾到微球表面,合成均勻且粒徑單分散的新型亞微米兩性離子親水作用色譜固定相(Cys-VTMS-SiO2)。將甲苯、丙烯酰胺和硫脲作為親水作用色譜柱性能考察的分離物質(zhì),以pCEC為平臺(tái),通過對電壓、緩沖鹽濃度和緩沖液pH進(jìn)行優(yōu)化,實(shí)現(xiàn)化合物的分離研究。將填充柱成功用于核苷類、酚類、胺類和多肽化合物的快速分離,柱效高,為極性化合物和親水化合物的分離研究提供了新方法和新思路。