慢性萎縮性胃炎胃黏膜Runx3基因及蛋白表達(dá)與幽門螺桿菌感染的關(guān)系研究

夏 韜，丁西平，朱 敏，王 衛(wèi)

(1.安徽醫(yī)科大學(xué)附屬省立醫(yī)院消化內(nèi)科，合肥 230001；2.安徽省廬江縣人民醫(yī)院消化內(nèi)科 231500)

胃癌是常見的消化道惡性腫瘤之一，嚴(yán)重威脅人類的健康。近年來，隨著人們良好飲食習(xí)慣的形成及幽門螺桿菌(Hp)的根除，胃癌的發(fā)病率有所下降，但發(fā)病率及病死率仍高居全球前列[1-2]。據(jù)2015年中國(guó)癌癥數(shù)據(jù)報(bào)告，我國(guó)胃癌的發(fā)病率和病死率在惡性腫瘤中均高居第2位[3]。胃癌發(fā)生受多種因素影響，并且是一個(gè)多階段的逐步發(fā)展過程。在慢性萎縮性胃炎(CAG)的基礎(chǔ)上發(fā)生的腸上皮化生和不典型增生等變化被稱為胃癌前病變，其是否進(jìn)一步發(fā)展為胃癌還受Hp感染、環(huán)境和遺傳等多因素的影響[4-5]。Runx3基因作為目前公認(rèn)的抑癌基因，近年來研究認(rèn)為其甲基化與胃癌及CAG密切相關(guān)[6]。因此，通過研究CAG患者胃黏膜中Runx3基因表達(dá)與Hp感染的關(guān)系，對(duì)了解二者在CAG中的相互影響具有重要意義。本研究使用實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)及免疫蛋白印跡法(Western blot)分析了CAG患者根除Hp前后胃黏膜中Runx3基因及蛋白表達(dá)的變化，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 資料與方法

1.1一般資料 選取2016年1月至2017年6月于廬江縣人民醫(yī)院及安徽省立醫(yī)院經(jīng)胃鏡檢查及病理證實(shí)的CAG患者80例作為研究對(duì)象。納入標(biāo)準(zhǔn)：(1)年齡大于或等于18歲；(2)首次診斷患者；(3)經(jīng)胃鏡及病理證實(shí)為中、重度CAG；(4)簽署知情同意書。排除標(biāo)準(zhǔn)：(1)自身免疫性胃炎、胃食管反流病、消化道潰瘍及消化道出血等消化道其他良性病變患者；(2)消化道惡性腫瘤患者；(3)近期(3個(gè)月)內(nèi)服用葉酸、維生素B12的患者；(4)有胃部手術(shù)史的患者；(5)伴有嚴(yán)重心腦血管病、全身感染性疾病及臟器衰竭的患者；(6)妊娠期、 哺乳期或準(zhǔn)備受孕的婦女；(7)不愿按要求完成研究或有精神病的患者。本研究經(jīng)安徽省立醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，患者均簽署知情同意書。根據(jù)Hp感染情況，將53例Hp陽性患者作為觀察組，將27例Hp陰性患者作為對(duì)照組。兩組間性別、年齡、體質(zhì)量指數(shù)(BMI)、吸煙及飲酒比例等一般資料比較，差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，見表1。

1.2儀器與試劑 主要儀器：凝膠圖像分析儀(珠海黑馬醫(yī)學(xué)儀器有限公司)，Tprofessional Thermocycler PCR儀(美國(guó)Biometra公司)，實(shí)時(shí)定量PCR儀(美國(guó)ABI公司)，紫外分光光度計(jì)(日本日立公司)，低溫高速離心機(jī)、電子天平、移液器(德國(guó)Eppendorf公司)。主要試劑：組織基因組提取試劑盒(天根生化科技有限公司)、Wizard DNA Clean-Up System試劑(美國(guó)Promega公司)、PCR引物(大連寶生物工程有限公司)、甲基化酶 SssI(美國(guó)New England Biolabs公司)，Taq plus PCR Master-Mix、SYBR Green Ⅰ Mastex、Runx3小鼠抗人單抗(美國(guó)Santa Cruz公司)，羊抗鼠IgG(北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司)。

1.3試驗(yàn)方法 (1)胃鏡檢查：納入者均由固定的內(nèi)鏡醫(yī)師行胃黏膜取材，根據(jù)病變部位選取胃黏膜進(jìn)行活檢病理檢查及液氮保存。病理檢查由兩名病理科醫(yī)師進(jìn)行讀片確定。(2)診斷：CAG的診斷參照《中國(guó)慢性胃炎共識(shí)意見》[4]，包括內(nèi)鏡診斷和病理診斷；確診以病理診斷為依據(jù)。(3)Hp檢驗(yàn)：采用國(guó)際公認(rèn)的金標(biāo)準(zhǔn)C13尿素呼氣試驗(yàn)。(4)Hp根治：參照《第4次全國(guó)幽門螺桿菌感染處理共識(shí)報(bào)告》[7]推薦方案，根治2個(gè)月后復(fù)查C13尿素呼氣試驗(yàn)。(5)Runx3基因甲基化檢測(cè)：對(duì)提取DNA進(jìn)行亞硫酸氫鈉修飾和純化，然后進(jìn)行甲基化特異性PCR(MSP)及電泳分析。(6)Runx3基因mRNA的表達(dá)：提取胃鏡所取胃黏膜組織mRNA，反轉(zhuǎn)錄合成cDNA；設(shè)標(biāo)準(zhǔn)品校正和去離子水(ddH2O)代替DNA模板的陰性對(duì)照，每份樣品均同時(shí)做2個(gè)平行復(fù)孔進(jìn)行qPCR。以β-actin為內(nèi)參，并對(duì)所有樣品進(jìn)行均一化處理。(7)Runx3蛋白表達(dá)的測(cè)定：提取總蛋白后進(jìn)行十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)分離，Runx3檢測(cè)條帶44×103，內(nèi)參甘油醛-3-磷酸脫氫酶(GAPDH)條帶36×103。Image J軟件分析條帶灰度值，目的蛋白相對(duì)表達(dá)水平=目的蛋白條帶灰度值/內(nèi)參條帶灰度值。

2 結(jié) 果

2.1Hp感染對(duì)中、重度CAG患者胃黏膜Runx3基因甲基化的影響 MSP法檢測(cè)CAG患者胃黏膜Runx3基因甲基化情況，見圖1。對(duì)照組中8例患者胃黏膜Runx3基因甲基化，陽性率為29.6%(8/27)；觀察組中28例患者胃黏膜Runx3基因甲基化，陽性率為52.8%(28/53)。兩組Runx3基因甲基化陽性率比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=3.890，P=0.049)。

表1 兩組一般資料比較

MA：標(biāo)記物;MP：甲基化陽性對(duì)照；UP：非甲基化陽性對(duì)照；C：空白對(duì)照；1：觀察組重度CAG患者胃黏膜標(biāo)本；2：對(duì)照組中度CAG患者胃黏膜標(biāo)本；3：觀察組中度CAG患者胃黏膜標(biāo)本；4：對(duì)照組重度CAG患者胃黏膜標(biāo)本

圖1 MSP法檢測(cè)CAG患者胃黏膜Runx3基因甲基化

2.2Hp感染對(duì)中、重度CAG患者胃黏膜Runx3基因mRNA和蛋白表達(dá)的影響 觀察組患者胃黏膜Runx3 mRNA表達(dá)水平低于對(duì)照組，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=1.233，P=0.221)。亞組分析顯示，觀察組中度CAG患者胃黏膜Runx3 mRNA表達(dá)水平低于對(duì)照組中度CAG患者，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=0.552，P=0.583)；觀察組重度CAG患者胃黏膜Runx3 mRNA表達(dá)水平低于對(duì)照組重度CAG患者，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=2.226，P=0.036)，見表2。觀察組CAG患者胃黏膜Runx3蛋白表達(dá)水平低于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=2.143，P=0.035)，見圖2。亞組分析顯示，觀察組中度CAG患者胃黏膜Runx3蛋白表達(dá)水平低于Hp陰性的對(duì)照組中度CAG患者，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=1.468，P=0.148)；觀察組重度CAG患者胃黏膜Runx3蛋白表達(dá)水平低于對(duì)照組重度CAG患者，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=2.240，P=0.035)，見表2。

表2 兩組Runx3 mRNA及蛋白表達(dá)水平比較

*：P<0.05，與對(duì)照組比較

2.3根除Hp對(duì)中、重度CAG患者胃黏膜Runx3基因甲基化、mRNA及蛋白表達(dá)的影響 根除Hp治療后2個(gè)月復(fù)查，觀察組53例CAG患者中44例轉(zhuǎn)陰，9例仍為陽性(中度CAG患者6例、重度CAG患者3例)。觀察組中44例Hp轉(zhuǎn)陰CAG患者根除Hp前有22例Runx3基因甲基化陽性，根除后6例轉(zhuǎn)為陰性。與根除前比較，根除Hp后中重度CAG患者胃黏膜Runx3 mRNA表達(dá)水平升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=-3.249，P=0.002)；亞組分析顯示，與根除前比較，根除Hp后中度及重度CAG患者胃黏膜Runx3 mRNA表達(dá)水平升高，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=-2.460、-2.534，P=0.020、0.028)，見表3。與根除前比較，根除Hp后中重度CAG患者胃黏膜Runx3蛋白表達(dá)水平升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=-3.166，P=0.003)，見圖3；亞組分析顯示，與根除前比較，中度及重度CAG患者胃黏膜Runx3蛋白表達(dá)水平升高，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=-2.164、-2.724，P=0.038、0.020)，見表3。

表3 CAG轉(zhuǎn)陰患者根除Hp前后Runx3 mRNA及蛋白表達(dá)水平比較

*：P<0.05，與根除前比較

圖2 Western blot檢測(cè)Runx3蛋白在對(duì)照組及觀察組CAG患者胃黏膜組織中的表達(dá)

圖3 Western blot檢測(cè)Runx3蛋白在中重度患者根治前后胃黏膜組織中的表達(dá)

3 討 論

現(xiàn)代醫(yī)學(xué)觀點(diǎn)認(rèn)為，臨床多數(shù)疾病的發(fā)生是由遺傳因素和環(huán)境因素共同作用的結(jié)果[8]。如胃癌的發(fā)生、發(fā)展與遺傳學(xué)、表觀遺傳學(xué)、Hp感染及飲食習(xí)慣的相關(guān)性已得到學(xué)術(shù)界的公認(rèn)，而且基因多態(tài)性及表觀遺傳學(xué)與Hp感染的交互作用研究已有報(bào)道[9-10]。JIA等[11]研究顯示，Hp感染所致胃黏膜的慢性炎癥可增加患者的遺傳基因易感性，能夠?qū)е挛葛つひ职┗虻漠惓＜谆?，在促進(jìn)胃癌的發(fā)生過程中具有重要作用。HONG等[12]報(bào)道，Hp感染可通過在胃癌前病變中的炎性反應(yīng)和低胃酸環(huán)境，使伴有白細(xì)胞介素-1β(IL-1β)基因多態(tài)性的患者更易發(fā)生胃癌。CAG的發(fā)生、發(fā)展亦是基因與環(huán)境共同及相互作用的結(jié)果。不良環(huán)境和不健康飲食習(xí)慣的暴露可通過多種途徑影響抑癌基因的表達(dá)，包括自身基因多態(tài)性及表觀遺傳學(xué)的改變，進(jìn)而共同促進(jìn)CAG及胃癌的發(fā)生、發(fā)展。慢性胃炎特別是CAG的發(fā)生、發(fā)展過程受多種因素影響，反復(fù)或持續(xù)Hp感染、不良飲食習(xí)慣等均為促進(jìn)及加重胃黏膜萎縮和腸化生的潛在因素,可導(dǎo)致CAG的患病風(fēng)險(xiǎn)增高并增加癌變的可能[13-15]。

Runx3基因?yàn)镽unx家族的重要成員之一，目前研究表明Runx3啟動(dòng)子區(qū)CpG島的異常甲基化可直接導(dǎo)致基因靜默和表達(dá)缺失引起基因和蛋白表達(dá)的降低，進(jìn)而導(dǎo)致其抑癌作用的失活[16-17]。近年有研究發(fā)現(xiàn)，Runx3基因的抑癌作用源于它是轉(zhuǎn)換生長(zhǎng)因子-β(TGF-β)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路中的轉(zhuǎn)錄因子，在Runx蛋白的參與下，通過Smad復(fù)合物與靶位點(diǎn)的結(jié)合，TGF-β/Smad復(fù)合物才能從細(xì)胞質(zhì)轉(zhuǎn)入細(xì)胞核內(nèi)的功能靶點(diǎn)，發(fā)揮調(diào)控細(xì)胞生長(zhǎng)發(fā)育、凋亡和惡性轉(zhuǎn)化等作用[18]。Runx3基因內(nèi)含2個(gè)高度保守的CpG島，其甲基化水平可影響基因表達(dá)；當(dāng)Runx3 表達(dá)失活時(shí)，影響TGF-β信號(hào)通路的轉(zhuǎn)導(dǎo)，可以參與胃癌等多種疾病的發(fā)生[19-21]。CAG為胃癌的癌前病變，了解胃癌的多個(gè)相關(guān)因素，如Hp及Runx基因在CAG中的相互作用具有一定的臨床意義。黃唯等[22]的研究已證實(shí)，CAG患者存在Runx3基因的表達(dá)下調(diào)，且Runx3基因表達(dá)水平降低與CAG及胃癌的發(fā)生、發(fā)展存在一定的相關(guān)性。

有研究認(rèn)為，Runx3 mRNA及蛋白的表達(dá)與CAG的嚴(yán)重程度有關(guān)，而甲基化可能是導(dǎo)致Runx3蛋白表達(dá)下調(diào)的主要原因[23-24]。DNA甲基化主要發(fā)生在富含CpG島的啟動(dòng)子區(qū)域，通過該區(qū)域的甲基化將直接阻礙轉(zhuǎn)錄因子與啟動(dòng)子結(jié)合，從而使基因不能轉(zhuǎn)錄或轉(zhuǎn)錄水平降低[25]。因此，重度CAG患者胃黏膜Runx3基因及蛋白表達(dá)下降可能與CAG患者Runx3基因高甲基化影響mRNA的表達(dá)有關(guān)。CHOI等[26]研究提示，胃癌伴Hp感染患者胃黏膜Runx3基因的表達(dá)水平低于Hp陰性者，考慮與Hp感染可能誘使Runx3基因甲基化，從而導(dǎo)致抑癌基因Runx3失活，下調(diào)Runx3基因的表達(dá)。本研究顯示，觀察組患者胃黏膜Runx3 mRNA及蛋白表達(dá)水平低于對(duì)照組；亞組分析提示，觀察組中度CAG患者胃黏膜Runx3蛋白表達(dá)水平低于對(duì)照組中度CAG患者，而mRNA的表達(dá)水平在觀察組與對(duì)照組中度CAG患者間無明顯差異；觀察組重度CAG患者胃黏膜Runx3 mRNA及蛋白表達(dá)水平均低于對(duì)照組重度CAG患者，與黃唯等[22]研究結(jié)果相似。提示CAG患者胃黏膜Runx3 mRNA及蛋白的表達(dá)不但與CAG的嚴(yán)重程度相關(guān)，而且與Hp感染密切相關(guān)；尤其在重度CAG伴Hp感染患者中，胃黏膜Runx3 mRNA及蛋白的表達(dá)下降明顯。研究結(jié)果顯示，觀察組患者Runx3基因甲基化率高于對(duì)照組，因此在CAG伴Hp感染患者尤其是重度CAG伴Hp感染患者中，Hp感染可能在原有Runx3基因甲基化基礎(chǔ)上誘導(dǎo)甲基化進(jìn)一步加重，引起抑癌基因Runx3失活，導(dǎo)致Runx3基因及蛋白表達(dá)的下調(diào)。Runx3基因及蛋白低表達(dá)和Hp感染在胃癌發(fā)生、發(fā)展過程中有協(xié)同作用；因此，在Hp感染的CAG患者中應(yīng)予以積極根除Hp治療。

本研究顯示，在CAG伴Hp感染患者尤其是重度CAG伴Hp感染患者中，Hp感染可能誘導(dǎo)甲基化進(jìn)一步加重，導(dǎo)致抑癌基因Runx3 mRNA及蛋白表達(dá)均明顯下降。根除Hp治療后2個(gè)月，中、重度CAG患者胃黏膜Runx3 mRNA及蛋白表達(dá)水平明顯升高；亞組分析顯示，中度及重度CAG患者胃黏膜Runx3 mRNA表達(dá)水平均升高；且根除Hp治療后部分CAG患者Runx3基因甲基化陽性轉(zhuǎn)為陰性。研究結(jié)果進(jìn)一步證實(shí)Hp感染可能通過誘導(dǎo)甲基化引起抑癌基因Runx3失活，導(dǎo)致Runx3基因及蛋白低表達(dá)；而在根除Hp后，可逆轉(zhuǎn)Hp感染所致的抑癌基因Runx3 mRNA及蛋白表達(dá)下降。因此，在對(duì)Hp感染的CAG患者應(yīng)積極予以根除Hp治療，可以消除Hp在CAG發(fā)展中作用及激活抑癌基因Runx3的抑癌作用，其具體調(diào)節(jié)機(jī)制有待于進(jìn)一步研究。