人工干預(yù)對黃河源區(qū)沙化草地土壤微生物群落的影響

張文娟，薛 嫻，彭 飛，尤全剛，潘 晶，李成陽，賴熾敏

（1.中國科學(xué)院西北生態(tài)環(huán)境資源研究院 / 中國科學(xué)院沙漠與沙漠化重點實驗室，甘肅 蘭州 730000；2.中國科學(xué)院大學(xué)，北京 100049；3.福建農(nóng)林大學(xué)林學(xué)院，福建 福州 350000）

沙漠化作為土地退化的一種主要表現(xiàn)形式，影響社會經(jīng)濟(jì)和生態(tài)環(huán)境的可持續(xù)發(fā)展以及人類的生存和進(jìn)步[1]。青藏高原是全球獨特的地域單元，近年來區(qū)內(nèi)土地沙漠化不斷發(fā)展，已成為當(dāng)?shù)刂饕纳鷳B(tài)環(huán)境問題之一[2]。2015年我國青藏高原沙漠化土地總面積已達(dá)到39.29萬km2，約占整個青藏高原區(qū)土地總面積的15.1%[3]。沙漠化土地廣泛分布在柴達(dá)木盆地、藏北高原、青南高原和大江大河河谷區(qū)[4]。

黃河源區(qū)位于青藏高原東部，是黃河重要的水源涵養(yǎng)區(qū)和補(bǔ)給區(qū)，歷史時期湖泊密布[5-6]。然而，青藏高原抬升和氣候變干，導(dǎo)致大湖泊開始解體、小湖泊逐漸干涸，在土層較薄的湖相沉積物上逐漸形成高寒草原[7]。近幾十年，受氣候變暖和不合理的人類活動影響，黃河源區(qū)的沙漠化土地總面積達(dá) 22 042.32 km2，占該區(qū)總土地面積的 16.77%，且沙漠化土地的面積和程度呈劇增態(tài)勢[8]；其主要分布在巴顏喀拉山北麓，散布于黃河干流兩側(cè)的湖泊周圍、河谷灘地、河岸階地及干涸湖灘[9]。黃河源區(qū)土地沙漠化影響畜牧業(yè)發(fā)展，危及黃河流域用水安全，是黃河源區(qū)最主要的生態(tài)環(huán)境問題[10-11]。

草方格沙障是沙漠化治理最有效的一種措施，被廣泛應(yīng)用于我國北方沙漠化防治中[12]。黃河源區(qū)以高寒草地畜牧業(yè)為主，缺乏制作草方格的麥草和稻草等材料，且氣候較為濕潤，降雨較多，草方格沙障易腐爛，使用年限短[13]。因此，當(dāng)?shù)厝嗣窭玫[石方格沙障代替草方格沙障作為固沙措施，并結(jié)合播草種的方法進(jìn)行沙漠化治理[14-15]。但目前示范區(qū)內(nèi)沙化土地治理的成效還沒有相關(guān)研究和報道。因此，有必要對示范區(qū)內(nèi)礫石方格沙障/播草種的沙漠化土地恢復(fù)措施進(jìn)行研究和評價，從而為今后高寒地區(qū)沙化土地的治理提供理論指導(dǎo)。

一般來講，退化土地恢復(fù)成效主要從土壤、植被和微生物3個方面進(jìn)行評價[16]。但是研究區(qū)氣候寒冷、成壤作用弱、土壤發(fā)育程度較低，人工干預(yù)措施影響下土壤和植被的恢復(fù)過程相對緩慢[17]。土壤微生物作為生態(tài)系統(tǒng)的重要組成部分，其多樣性和群落結(jié)構(gòu)的變化可以反映土壤生態(tài)功能的變化[18-20]。因此，土壤微生物群落組成及結(jié)構(gòu)變化可作為土壤環(huán)境及植被變化的指示因子。本研究采用MiSeq測序方法，以黃河源區(qū)沙化草地為研究對象，對不同人工干預(yù)措施和不同恢復(fù)年限樣地的土壤細(xì)菌和真菌群落組成進(jìn)行高通量測序，旨在了解不同恢復(fù)措施對細(xì)菌和真菌群落結(jié)構(gòu)及其動態(tài)變化的影響，揭示不同干預(yù)措施和恢復(fù)時間在沙化草地恢復(fù)中對土壤微生物種群演化的作用，以期為進(jìn)一步開展黃河源區(qū)沙化防治工作提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 研究區(qū)概況

圖1 研究區(qū)位置及采樣地點示意圖Figure 1 Location of the study area and sampling plots

研究區(qū)被稱為綿沙嶺，位于黃河源區(qū)214國道沿線(K504)的星星海湖岸沙地。研究區(qū)位置及采樣地點如圖1所示，地處 34°44'57.85" N，98°07'06.32" E，海拔 4 241 m。年平均氣溫 5.1 ℃，年平均降水量313.8 mm，其中86%的降水發(fā)生在5-9月[10]。研究區(qū)天然植被為高寒草原，其群落稀疏，結(jié)構(gòu)簡單，主要以紫花針茅(Stipa purpurea)為建群種，伴生種有紫羊茅(Festuca rubra)、異針茅(S.aliena)、座花針茅(S.subsessiliflora)、釘柱委陵菜(Potentilla saundersiana)、細(xì)葉亞菊(Ajania tenuifolia)、沙生風(fēng)毛菊(Saussurea arenaria)、乳白香青(Anaphalis lacteal)、矮火絨草(Leontopodium nanum)、鐮形棘豆(Oxytropis falcate)和鐵棒槌(Aconitum pendulum)等[21]。研究區(qū)草地退化后，植被主要由沙生風(fēng)毛菊、鋪散亞菊(Ajania khartensis)、垂穂披堿草(Elymus nutans)、紫菀(Aster tataricus)等組成。研究區(qū)退化之前土壤為高寒草原土，多為水成、半水成土，土層較淺，在高寒氣候條件下，土壤成土過程十分緩慢[2, 17]。

自2005年開始，瑪多縣政府組織當(dāng)?shù)孛癖婇_展工程和生物措施治理沙化土地。在星星海與214 國道之間的沙化土地上布設(shè)了規(guī)格為 2 m × 2 m的礫石方格沙障，面積約247 hm2。沙面穩(wěn)定后在沙障內(nèi)人工播撒了垂穂披堿草、早熟禾(Poa annua)等禾本科植物的草種。

1.2 試驗設(shè)計和樣品采集

本研究選擇了4種不同類型樣地，其中選擇鄰近干涸湖泊區(qū)域無人工措施干預(yù)的沙漠化區(qū)作為對照樣地，記為CK，4年播草種樣地記為P1(2013年)，4年礫石方格沙障 + 播草種樣地記為P2(2013年)，12年礫石方格沙障 + 播草種樣地記為P3(2005年)。選擇CK樣地作為其他3個有人工干預(yù)措施樣地的對照，以P1樣地和P2樣地對比分析不同干預(yù)措施對土壤環(huán)境的影響，P3樣地與P2樣地對比分析不同干預(yù)時間的礫石方格沙障 +播草種對土壤微生態(tài)環(huán)境的影響。

2017年7月在研究區(qū)4個樣地進(jìn)行樣品采集。在每個樣地內(nèi)分別隨機(jī)選取3個樣方，為3個重復(fù)。利用 30 cm × 30 cm 樣方框?qū)拥貎?nèi)植被蓋度及植物群落組成進(jìn)行調(diào)查，并用齊地面刈割法收獲地上生物量[22]。在樣方內(nèi)采用土柱法 (Φ = 60 mm)收集植物地下部分(0-10 cm)，用細(xì)水將泥土沖洗干凈后烘干根系并稱量其生物量[23]。同時，利用剖面法取地表0-10 cm土樣，將其分為兩部分：一部分用于測定土壤容重、含水量、有機(jī)碳、硝態(tài)氮及銨態(tài)氮；另一部分經(jīng)混合(3個樣品合為一個)、均質(zhì)、除雜(過1 mm篩)后收集在無菌離心管中，密封后使用干冰運(yùn)至北京奧維森基因科技有限公司(http://www.allwegene.com/)進(jìn)行測序(高通量測序樣品在野外采集完成后，放置于內(nèi)置冰盒的車載保溫箱內(nèi)，然后運(yùn)抵實驗室)。

1.3 研究方法

1.3.1 土壤理化性質(zhì)測定

土壤容重采用100 cm3環(huán)刀取樣測定；土壤含水量測定采用烘干法 (恒溫 105 ℃, 48 h)，稱干土重，計算土壤含水量；有機(jī)碳測定采用重鉻酸鉀容量法-外加熱法；土壤硝態(tài)氮和銨態(tài)氮測定采用美譜達(dá)UV-3300分光光度儀(中國，上海，美普達(dá)儀器有限公司)[24]。

1.3.2 土壤微生物多樣性檢測

稱取0.5 g新鮮土壤樣品進(jìn)行微生物基因組總DNA的抽提，運(yùn)用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測基因組DNA的完整性，并鑒定DNA含量。PCR擴(kuò)增采 用 TransGen AP221-02： TransStart Fastpfu DNA Polymerase；每個樣本3個重復(fù)，將同一樣本的PCR產(chǎn)物混合后用2%瓊脂糖凝膠電泳檢測，使用AxyPrepDNA凝膠回收試劑盒(AXYGEN公司)切膠回收PCR產(chǎn)物，Tris-HCl洗脫；2%瓊脂糖電泳檢測。細(xì)菌16S rRNA基因通用引物為338F/806R[25]，真菌ITS rRNA基因區(qū)引物ITS1-F/ITS2[26]。參照電泳初步定量結(jié)果，將PCR產(chǎn)物用QuantiFluor?-ST藍(lán)色熒光定量系統(tǒng)(Promega公司)進(jìn)行檢測定量，之后按照每個樣本的測序量要求進(jìn)行相應(yīng)比例的混合?；?Illumina MiSeq PE300 測序平臺在北京奧維森基因科技有限公司上機(jī)測序。原始下機(jī)序列已提交到NCBI的SRA數(shù)據(jù)庫(登錄號：PRJNA490458)。

1.4 統(tǒng)計學(xué)分析

運(yùn)用QIIME(v1.8.0)軟件得到基于門和綱分類級別的細(xì)菌與真菌的相對豐度柱狀圖。Heatmap(熱圖)是基于Bray-Curtis法計算進(jìn)化距離，運(yùn)用臨接法(neighbor-joining method)分析后通過R語言vegan包完成。采用SPSS 17.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析，用平均值和標(biāo)準(zhǔn)誤表示測定結(jié)果，組間比較采用單因素方差 (One-way ANOVA)分析，P＜ 0.05 有統(tǒng)計學(xué)意義 (SPSS for Windows, Version 17.0, Chicago, IL)。

2 結(jié)果

2.1 不同干預(yù)措施樣地的土壤和植被特征

表層土壤容重、含水量以及銨態(tài)氮含量在CK、P1、P2和 P3樣地之間均無顯著差異 (P＞ 0.05)(表 1)。土壤有機(jī)碳和硝態(tài)氮含量在CK、P1及P2樣地之間無顯著差異(P＞ 0.05)，而P3樣地表層土壤中有機(jī)碳和硝態(tài)氮含量顯著高于CK、P1和P2樣地的土壤有機(jī)碳和硝態(tài)氮含量(P＜ 0.05)。與CK、P1和P2樣地相比，P3樣地的土壤有機(jī)碳含量分別高出190.09%、60.98%和115.44%。與CK、P1和P2樣地相比，P3樣地的土壤硝態(tài)氮含量分別高出272.50%、60.12%和222.61%。

植被物種豐富度和總地上生物量在4個樣地之間無顯著差異(P＞ 0.05)，而雜類草地上生物量在P3樣地顯著高出 CK 樣地 342.27%(P＜ 0.05)(表 1)。植被蓋度在CK、P1和P2樣地之間無顯著差異(P＞0.05)，但P3樣地的植被蓋度顯著高于CK和P2樣地的植被蓋度(P＜ 0.05)。與CK和P2樣地相比，P3樣地的植被蓋度分別高出480.00%和148.39%。

2.2 基于MiSeq測序的不同干預(yù)措施樣地的物種組成

2.2.1 細(xì)菌群落組成

在門分類水平放線菌門(Actinobacteria)、變形菌門(Proteobacteria)、酸桿菌門(Acidobacteria)、綠彎菌門(Chloroflexi)、擬桿菌(Bacteroidetes)、芽單胞菌門(Gemmatimonadetes)等21個共有門在CK、P1、P2和P3樣品中分別占比為99.19%、99.80%、99.87%和99.89%。排在第1位的菌群是放線菌門，該細(xì)菌種類在CK、P1、P2和P3樣地中相對豐度分別為30.33%、38.12%、23.20%和30.61%。變形菌門在CK、P1、P2和P3樣地中相對豐度分別為26.81%、22.24%、36.24%和28.61%。放線菌門在P1樣地中相對豐度最高，變形菌門在P2樣地相對豐度最高(圖 2a)。

在綱分類水平，α-變形菌綱(α-Proteobacteria)在4個樣地中占比最高且波動性較大，在CK、P1、P2和P3樣地的相對豐度分別為16.35%、16.73%、19.65%和26.97%(圖 2b)。β-變形菌綱 (β-Proteobacteria)、γ-變形菌綱 (γ-Proteobacteria)和 δ-變形菌綱 (δ-Proteobacteria)在各個樣地中占比均較低且波動較小，3種變形菌綱的相對豐度分別為3.67%、3.07%和1.80%(圖2b)。

表1 不同干預(yù)措施樣地土壤和植被特征 (n = 3)Table 1 Properties of the plant community and soil for each sample plot under different intervention measures (n = 3)

2.2.2 真菌群落組成

在門分類水平，子囊菌門(Ascomycota)在CK、P1、P2和P3樣地相對豐度最高，分別占比為79.17%、61.67%、66.78%和71.61%。擔(dān)子菌門(Basidiomycota)排在第2位，其在4個樣地中的相對豐度分別為4.87%、7.86%、10.42%和18.58%。子囊菌門在CK樣地中相對豐度最高，擔(dān)子菌門在P3樣地中相對豐度最高(圖3a)。

圖2 不同干預(yù)措施樣地土壤樣品在門水平(a)細(xì)菌群落相對豐度評估和綱水平變形菌(b)分布百分比Figure 2 Relative abundance of the bacterial community at the phylum (a) level and the class distribution of Proteobacteria (b) for each sample plot under different intervention measures

圖3 不同干預(yù)措施樣地土壤樣品在門水平(a)和綱水平(b)真菌群落相對豐度評估Figure 3 Relative abundance of the fungal community at the phylum (a) and class (b) levels for each sample plot under different intervention measures

在綱分類水平，糞殼菌綱(Sordariomycetes)在4類樣地中的相對豐度最高且變化較小，平均值為22.75%。未識別的菌綱在CK、P1和P23類樣地中相對豐度較高，為14.50%～34.20%；在P3樣地中相對豐度最低，為5.01%。P3樣地的座囊菌綱(Dothideomycetes)和銀耳菌綱(Tremellomycetes)相對豐度最高，分別為40.75%和15.03%。相反，錘舌菌綱(Leotiomycetes)的相對豐度在對照樣地CK中最高，為25.40%；在P3樣地中相對豐度最低，為3.42%(圖 3b)。

2.3 不同干預(yù)措施樣地微生物群落的β-多樣性

在基于豐度比較高的前20個屬水平的細(xì)菌類群的熱圖(圖4a)中，CK和P1樣地的細(xì)菌群落聚類為一組，P2和P3樣地的細(xì)菌群落聚成另一組，這表明CK和P1樣地的細(xì)菌群落相似系數(shù)較高，P2和P3樣地的細(xì)菌群落相似系數(shù)較高。在基于豐度比較高的前20個科水平的真菌類群的熱圖(圖4b)中，CK和P1樣地的真菌群落首先聚類在一起，然后再與P2樣地的真菌聚在一起，P3樣地的真菌群落單獨為一組，這表明CK、P1和P2樣地的真菌群落相似系數(shù)較高而P3樣地的真菌群落與CK、P1和P2樣地的真菌群落差異性比較大。

3 討論

土壤細(xì)菌和真菌是土壤有機(jī)物質(zhì)礦化和腐殖質(zhì)化過程的重要參與者[27]，其群落多樣性變化受土壤肥力[28-29]及植被特性[30-31]的影響。同時，土壤微生物又能夠調(diào)節(jié)植物生長，其在土壤中的數(shù)量及分布反映了植被的生長發(fā)育狀況和土壤肥力變化趨勢[32]。相關(guān)研究發(fā)現(xiàn)，細(xì)菌群落的放線菌門在極端環(huán)境中非常豐富，而變形菌門則更多地生長在土壤肥力較高和植物相對較為豐富的環(huán)境[33-34]。本研究中細(xì)菌群落中的放線菌門在CK和P1樣地的相對豐度高于P2樣地；然而變形菌門，尤其是α-變形菌綱在CK和P1樣地的相對豐度低于P2樣地(圖2)。以上研究結(jié)果證實，4年修復(fù)期的礫石方格沙障 + 播草種相結(jié)合的人工干預(yù)措施對黃河源區(qū)沙化土地的改良作用優(yōu)于單純的播草種干預(yù)措施。盡管播草種干預(yù)措施在黃河源區(qū)黑土灘退化草地的修復(fù)中取得了很好的效果[35-36]，但研究區(qū)風(fēng)沙活動強(qiáng)烈、土壤發(fā)育微弱、土地貧瘠，只有與固沙措施相結(jié)合人工播草種才能更好地定殖與生長。細(xì)菌菌群聚類分析結(jié)果表明，與CK樣地相比，P1樣地的細(xì)菌群落沒有發(fā)生明顯變化，且兩類樣地的細(xì)菌菌群相似性較高聚為一組，進(jìn)一步說明僅僅使用人工補(bǔ)播這一種干預(yù)措施，在高寒地區(qū)沙化土地改良中的成效不甚明顯；而P2和P3樣地的細(xì)菌群落發(fā)生了顯著變化，且這兩種類型樣地的細(xì)菌菌群由于相似系數(shù)較高聚為一組(圖4a)，說明本研究區(qū)礫石方格沙障 + 播草種相結(jié)合的人工干預(yù)措施有效改善了沙化土地的微生態(tài)環(huán)境。但是，區(qū)域土壤成土過程十分緩慢，致使植被和土壤的修復(fù)成效并不顯著，因此研究區(qū)植被物種豐富度和總地上生物量及土壤容重、含水量和銨態(tài)氮等因子在4個樣地間均無顯著變化(P＞ 0.05)(表1)。

圖4 基于豐度比較高的前20個屬水平的細(xì)菌類群(a)和科水平的真菌類群(b)的熱圖Figure 4 Bacterial (a) and fungal (b) distributions of the top 20 abundant genera and families, respectively

真菌群落的子囊菌門在土壤養(yǎng)分貧瘠的環(huán)境中較豐富，而擔(dān)子菌門則在土壤養(yǎng)分充足的環(huán)境中最為豐富[37-38]。有研究表明，座囊菌綱雖然屬于子囊菌門，但其能在極端環(huán)境中通過改善水分和營養(yǎng)物質(zhì)的獲取而增強(qiáng)的植物生長[37]。本研究結(jié)果中，子囊菌門的座囊菌綱和擔(dān)子菌門的銀耳菌綱在P3樣地中豐富度最高。真菌菌群聚類分析結(jié)果表明，P3樣地的真菌群落與P2樣地的真菌群落差異系數(shù)較大(圖4b)，且植被蓋度及土壤有機(jī)碳、土壤硝態(tài)氮含量在P3樣地顯著高于CK和P2樣地(P＜0.05)(表 1)，說明礫石方格沙障 + 播草種相結(jié)合的干預(yù)措施其成效隨干預(yù)年限的延長而增強(qiáng)。

基于以上分析認(rèn)為，高寒地區(qū)沙化草地的治理，應(yīng)該采取工程措施和生物措施相結(jié)合的方法，綿沙嶺治沙科技先導(dǎo)示范區(qū)所采用的礫石方格沙障 +播草種相結(jié)合的干預(yù)措施優(yōu)于單一的播草種干預(yù)措施，促進(jìn)了沙化草地表層養(yǎng)分積累，改變了土壤微生物結(jié)構(gòu)，有利于植被的定殖和生長。但是，由于區(qū)域氣候寒冷、土壤成土過程緩慢，致使植被和土壤的修復(fù)過程長。而接種有益微生物菌劑能夠有效改善植物根基微生態(tài)環(huán)境，提高土壤水分和養(yǎng)分利用率，增強(qiáng)植物光合能力，促進(jìn)植物生長[39-40]。因此，可在礫石方格沙障 + 播草種的干預(yù)方式基礎(chǔ)上，通過施肥、添加微生物菌劑等措施快速提高土壤肥力，使黃河源區(qū)沙化土地得到有效治理。

4 結(jié)論

4年修復(fù)期的礫石方格沙障 + 播草種相結(jié)合的人工干預(yù)措施對黃河源區(qū)沙化土地的改良作用優(yōu)于單純的播草種干預(yù)措施，且礫石方格沙障+播草種相結(jié)合的人工干預(yù)措施對沙化草地的改善成效隨干預(yù)年限的延長而增強(qiáng)。