利用熒光SSR分析中國(guó)糜子的遺傳多樣性和群體遺傳結(jié)構(gòu)

寇淑君，霍阿紅，付國(guó)慶，紀(jì)軍建，王瑤，左振興，劉敏軒，陸平

（1張家口市農(nóng)業(yè)科學(xué)院，河北張家口075000；2中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院作物科學(xué)研究所，北京 100081）

0 引言

【研究意義】糜子（Panicum miliaceumL.）屬于禾本科黍?qū)伲≒anicum），為一年生草本植物，有2n=4x=36條染色體。糜子起源于中國(guó)，是最古老的栽培作物，距今已有10 000余年的栽培歷史[1］，具有抗旱、耐鹽堿、耐瘠，生育期短等特點(diǎn)[2］，不僅為干旱半干旱地區(qū)的人們提供糧食保障，也是該地區(qū)重要的救災(zāi)備荒作物[3］。中國(guó)糜子種質(zhì)資源非常豐富，目前，保存在國(guó)家種質(zhì)庫中的糜子資源超過8 800多份，如何準(zhǔn)確快速評(píng)估所保存資源的遺傳多樣性和群體遺傳結(jié)構(gòu)，對(duì)于開展糜子抗逆相關(guān)基因的挖掘，促進(jìn)糜子種質(zhì)創(chuàng)新和品種改良等具有重要意義。【前人研究進(jìn)展】分子標(biāo)記是揭示不同品種間遺傳多樣性和親緣關(guān)系的有效手段[4］，RAPD、AFLP等分子標(biāo)記曾被用于糜子的遺傳多樣性分析。M'RIBU等[5］應(yīng)用RAPD技術(shù)分析了 4類糜子的遺傳多樣性；KARAM 等[6］用AFLP標(biāo)記檢測(cè)了12份來自美國(guó)和加拿大的糜子遺傳多樣性；LáGLER等[7］使用來自草莓屬植物的 9個(gè)ISSR標(biāo)記在21份匈牙利糜子中共檢測(cè)到15個(gè)等位基因，其中7個(gè)引物能擴(kuò)增出DNA片段。SSR分子標(biāo)記具有共顯性、在基因組中含量豐富、多態(tài)性信息高、重復(fù)性好等優(yōu)點(diǎn)[8］，被廣泛用于各種作物的遺傳多樣性研究中[9-12］。近年來，利用SSR分子標(biāo)記對(duì)糜子的遺傳多樣性研究也取得了一些進(jìn)展。HU等[2］用46對(duì)來源于水稻、小麥、燕麥和大麥的SSR標(biāo)記分析了118份糜子資源的遺傳多樣性，PIC值為 0.284—0.980。CHO等[13］基于糜子基因組DNA富集SSR文庫開發(fā)了首批糜子SSR標(biāo)記，利用25個(gè)標(biāo)記在50份材料中檢測(cè)到110個(gè)等位變異。HUNT等[14］用16個(gè)標(biāo)記檢測(cè)了 98份來源于歐亞大陸的糜子地方品種的遺傳多樣性。連帥等[15］、LIU等[16］、薛延桃等[17］、王銀月等[18］用高通量測(cè)序手段開發(fā)的SSR標(biāo)記全面分析了中國(guó)糜子地方品種、育成品種、野生材料以及新引進(jìn)國(guó)外資源的遺傳多樣性和群體遺傳結(jié)構(gòu)。與傳統(tǒng)的聚丙烯酰胺凝膠電泳相比，毛細(xì)管電泳檢測(cè)技術(shù)具有靈敏度高、分辨率高、重復(fù)性好、所需樣品量少、分析通量大、可以有效減少錯(cuò)讀等優(yōu)點(diǎn)[19］，在玉米[20］、小麥[21］、煙草[22］、油菜[23］等植物中廣泛應(yīng)用，但在糜子上相關(guān)報(bào)道較少[14,24］?！颈狙芯壳腥朦c(diǎn)】已開展的遺傳多樣性研究結(jié)果顯示，糜子雖然是異源四倍體作物，但是其遺傳多樣性水平總體不高，一方面可能是目前可用于糜子遺傳多樣性研究的SSR分子標(biāo)記較少且多態(tài)性不高；另一方面多數(shù)研究采用的傳統(tǒng)聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測(cè)技術(shù)分辨率較低，不能準(zhǔn)確反映糜子不同材料間的遺傳多樣性。【擬解決的關(guān)鍵問題】本研究選用嚴(yán)格篩選后的22對(duì)SSR引物進(jìn)行熒光標(biāo)記，利用全自動(dòng)基因分析儀檢測(cè)技術(shù)分析來自中國(guó)不同生態(tài)區(qū)的72份糜子育成品種及59份當(dāng)?shù)刂饕r(nóng)家種的遺傳多樣性和群體遺傳結(jié)構(gòu)，為糜子品種改良、種質(zhì)創(chuàng)新和資源有效利用提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

試驗(yàn)材料包括由國(guó)家種質(zhì)資源庫提供的 72份育成品種（寧夏回族自治區(qū)11份、遼寧省2份、吉林省8份、黑龍江省10份、甘肅省8份、山西省16份、內(nèi)蒙古自治區(qū)14份和陜西省3份）和59份農(nóng)家種（寧夏回族自治區(qū)4份、遼寧省2份、吉林省2份、黑龍江省6份、甘肅省4份、山西省10份、內(nèi)蒙古自治區(qū)5份、陜西省5份、青海省8份、河北省9份、新疆維吾爾自治區(qū)3份和山東省1份）（電子附表1）。根據(jù)糜子栽培生態(tài)區(qū)劃[25］，131份材料所屬生態(tài)區(qū)包括東北春糜子區(qū)（30）、華北夏糜子區(qū)（3）、北方春糜子區(qū)（59）、黃土高原春夏糜子區(qū)（36）和西北春夏糜子區(qū)（3）。

1.2 DNA提取與檢測(cè)

每份材料隨機(jī)選取10個(gè)單株，采集三葉一心期幼嫩葉片混合后液氮中研磨，用新型植物基因組 DNA快速提取試劑盒（北京鼎國(guó)昌盛生物有限公司）提取基因組DNA，用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)DNA完整性，再用NanoDropND-1000檢測(cè)濃度并將擴(kuò)增濃度調(diào)成 50 ng·μL-1。

1.3 SSR引物

根據(jù)中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院作物科學(xué)研究所小宗作物課題組通過高通量測(cè)序技術(shù)開發(fā)的糜子基因組SSR引物和文獻(xiàn)中發(fā)表的引物信息，共選取202對(duì)SSR引物進(jìn)行合成。其中22對(duì)來源于連帥等[16］，4對(duì)來源于王銀月等[18］，178對(duì)來源于未發(fā)表的高通量測(cè)序開發(fā)的糜子SSR引物。對(duì)篩選出的SSR標(biāo)記的正向引物5′末端用6-FAM、HEX、ROX和TAMRA 4種熒光染料中的一種進(jìn)行標(biāo)記。引物的合成和標(biāo)記均由英濰捷基（上海）貿(mào)易有限公司完成。

1.4 PCR擴(kuò)增與標(biāo)記檢測(cè)

1.4.1 PCR擴(kuò)增 PCR擴(kuò)增體系包含11 μL的反應(yīng)體積，其中PCR Mix（北京擎科生物技術(shù)有限公司）5.5 μL、正向引物和反向引物各0.6 μL、基因組DNA 1 μL和ddH2O 3.3 μL。首先通過溫度梯度PCR擴(kuò)增，確定引物的最適退火溫度。PCR反應(yīng)程序（以退火溫度55℃為例）為98℃ 3 min；98℃ 10 s，55℃ 10 s，72℃ 10 s，30個(gè)循環(huán)；72℃ 3 min，4℃保存。

1.4.2 變性聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測(cè) 6%的聚丙烯酰胺凝膠，恒功率65 W預(yù)電泳15—20 min，每個(gè)加樣孔點(diǎn)入3 μL樣品，65 W恒功率電泳1—1.5 h，銀染檢測(cè)擴(kuò)增產(chǎn)物。

1.4.3 毛細(xì)管電泳熒光檢測(cè) 將6-FAM和HEX熒光標(biāo)記以及TAMRA和ROX熒光標(biāo)記的PCR產(chǎn)物分別用超純水稀釋10—30倍和5—10倍，隨后取等體積的上述4種稀釋液混合，從中吸取1 μL加到DNA分析儀深孔板中，同時(shí)加入0.1 μL LIZ500分子量?jī)?nèi)標(biāo)和8.9 μL去離子甲酰胺。將樣品在PCR儀上95℃變性5 min，立即取出置于碎冰上冷卻10 min后，放置到ABI 3730 XL型DNA分析儀上進(jìn)行自動(dòng)熒光檢測(cè)。

1.5 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

用Genemapper 4.0軟件自動(dòng)生成每個(gè)位點(diǎn)的圖譜文件，分析擴(kuò)增片段峰值，讀取擴(kuò)增片段大??；用PowerMarker3.25[26］計(jì)算每對(duì)引物的等位基因數(shù)（allele number）、主要等位基因頻率（major allele frequency）、基因多樣性指數(shù)（gene diversity index，H）、多態(tài)性信息含量指數(shù)（polymorphism information content，PIC）；用 Popgen1.32[27］計(jì)算 Shannon 信息指數(shù)（Shannon's Information index，I）；在MEGA 6.06[28］中構(gòu)建遺傳聚類圖；用STRUCTURE2.2.3[29］軟件進(jìn)行群體結(jié)構(gòu)分析。

2 結(jié)果

2.1 引物篩選與驗(yàn)證

利用地理來源遠(yuǎn)、形態(tài)差異大的6份糜子材料對(duì)收集的202對(duì)SSR引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，并對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行變性聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測(cè)，淘汰不具多態(tài)性或多態(tài)性差的引物，篩選出26對(duì)條帶清晰、多態(tài)性較高、擴(kuò)增穩(wěn)定的SSR引物。對(duì)26對(duì)高多態(tài)性SSR引物進(jìn)行毛細(xì)管熒光電泳檢測(cè)，結(jié)果表明，其中有22對(duì)引物的峰圖簡(jiǎn)單、多態(tài)性高、等位變異大小變化符合規(guī)律，可用于全部參試材料的遺傳多樣性分析（表1）。入選的22對(duì)引物既適用于傳統(tǒng)聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測(cè)技術(shù)，也適用于熒光 SSR標(biāo)記-全自動(dòng)分析檢測(cè)技術(shù)。

為了檢驗(yàn)熒光標(biāo)記毛細(xì)管電泳檢測(cè)方法的可靠性，用變性聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測(cè)方法對(duì)毛細(xì)管電泳檢測(cè)指紋數(shù)據(jù)進(jìn)行了驗(yàn)證。以引物BM2654為例（圖1），結(jié)果顯示在BM2654標(biāo)記位點(diǎn)上，6%變性聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測(cè)到6個(gè)等位基因，與圖2熒光毛細(xì)管電泳檢測(cè)到的大小分別是197、200、203、206、209和212 bp的多態(tài)性片段長(zhǎng)度一一對(duì)應(yīng)，說明熒光標(biāo)記毛細(xì)管電泳檢測(cè)方法結(jié)果可靠，能有效用于后續(xù)參試材料的遺傳多樣性研究。

圖1 45份糜子材料在BM2654標(biāo)記位點(diǎn)上的帶型表現(xiàn)Fig. 1 Alleles of 45 broomcorn millet accessions at marker locus BM2654

圖2 7份糜子材料在熒光標(biāo)記BM2654位點(diǎn)上的等位變異峰圖Fig. 2 Peak patterns detected in seven broomcorn millet accessions at fluorescent marker locus BM2654

2.2 中國(guó)糜子種質(zhì)資源SSR位點(diǎn)多樣性分析

利用22對(duì)引物在131份材料中共檢測(cè)出128個(gè)主要等位變異，變幅為2—8個(gè)，平均每對(duì)SSR引物擴(kuò)增出 5.82個(gè)主要等位變異，其中引物 LMX836、LMX2019、LMX2068、LMX2382擴(kuò)增出的等位變異最多，為8個(gè)。主要等位基因頻率為0.3015—0.7672，平均0.5241。多態(tài)性信息含量（PIC）的變幅介于0.2934—0.8150，平均0.5890，PIC最大的標(biāo)記為L(zhǎng)MX2382，最小的標(biāo)記為 BM6573。15個(gè)位點(diǎn)的 PIC＞0.5，為高度多態(tài)性位點(diǎn)，7個(gè)位點(diǎn)的PIC為0.25—0.5，為中度多態(tài)性位點(diǎn)。基因多樣性指數(shù)的變化范圍是 0.3572—0.8132，平均0.6276，其中，BM6573最低，LMX2019最高。Shannon多樣性指數(shù)為 0.5427—1.7681，平均1.2062，最高為 LMX2019，最低為 BM6573。基因多樣性指數(shù)，多態(tài)性信息含量，Shannon信息指數(shù)呈正相關(guān)，能夠反映每對(duì)標(biāo)記的鑒別能力。22個(gè)SSR位點(diǎn)的多態(tài)性豐富，可以檢測(cè)到不同糜子材料間豐富的遺傳多樣性。

表1 22對(duì)SSR標(biāo)記的遺傳參數(shù)Table 1 Genetic parameters of the 22 SSR markers used in this study

同時(shí)利用這 22對(duì)引物分析了不同生態(tài)區(qū)不同類型糜子資源的遺傳多樣性（表 2），不同生態(tài)區(qū)育成品種的基因多樣性指數(shù)、多態(tài)性信息含量、Shannon信息指數(shù)的變化范圍分別是 0.5474—0.5808、0.4953—0.5337、0.9848—1.1074，平均值為0.5608、0.5111和1.0433，其中黃土高原春夏糜子區(qū)育成品種的遺傳參數(shù)最高，北方春糜子區(qū)次之。不同生態(tài)區(qū)農(nóng)家種的基因多樣性指數(shù)、多態(tài)性信息含量、Shannon信息指數(shù)的變化范圍分別是0.3838—0.6221、0.3197—0.5725和0.4402—1.1114，平均值為 0.5041、0.4525和0.7806，其中北方春糜子區(qū)農(nóng)家種的遺傳參數(shù)最高，黃土高原春夏糜子區(qū)次之。總體來講，北方春糜子區(qū)各項(xiàng)遺傳參數(shù)均最高，黃土高原春夏糜子區(qū)次之，華北夏糜子區(qū)各項(xiàng)遺傳參數(shù)均最低，說明北方春糜子區(qū)和黃土高原春夏糜子區(qū)的遺傳多樣性比較豐富，北方春糜子區(qū)農(nóng)家種的遺傳多樣性豐富，可以從中挖掘優(yōu)良基因用于品種改良。

2.3 中國(guó)糜子種質(zhì)資源的遺傳相似性分析

利用 Popgene1.32計(jì)算不同生態(tài)區(qū)糜子種質(zhì)間的遺傳相似性（表3），結(jié)果顯示，遺傳距離的變化范圍為0.0764—0.7251，平均0.3121，遺傳一致度的變化范圍為0.4843—0.9265，平均0.7465。其中，北方春糜子區(qū)和黃土高原春夏糜子區(qū)的遺傳距離最?。?.0764），遺傳一致度最大（0.9265），這兩個(gè)生態(tài)區(qū)的地理位置相鄰，生態(tài)環(huán)境差異較小，親緣關(guān)系較近。華北夏糜子區(qū)和西北春夏糜子區(qū)的遺傳距離最大（0.7251），遺傳一致度最?。?.4843），這兩個(gè)生態(tài)區(qū)的地理分布較遠(yuǎn)，生態(tài)環(huán)境差異大，親緣關(guān)系較遠(yuǎn)。說明遺傳相似性與地理來源密切相關(guān)，地理來源越近，遺傳距離越小，遺傳一致度越高，親緣關(guān)系越近。

表2 不同生態(tài)區(qū)糜子的遺傳多樣性分析Table 2 Evaluation of genetic diversity of different ecotypes of broomcorn millet

表3 不同生態(tài)區(qū)糜子資源的遺傳距離和遺傳一致度Table 3 Genetic distance and genetic identity of broomcorn millet accessions with different ecotypes

2.4 基于遺傳距離的中國(guó)糜子種質(zhì)資源聚類分析

基于 UPGMA對(duì)不同生態(tài)區(qū)糜子材料進(jìn)行聚類（圖3），在遺傳距離0.1284處將5個(gè)生態(tài)區(qū)劃分為4個(gè)組群（組群Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ和Ⅳ）。組群Ⅰ將華北夏糜子區(qū)歸為一類，材料來自于山東省、河北省。組群Ⅱ?qū)⑽鞅贝合拿幼訁^(qū)歸為一類，材料來自于新疆維吾爾自治區(qū)。組群Ⅲ將東北春糜子區(qū)歸為一類，材料來自于黑龍江省、吉林省、遼寧省。組群Ⅳ將北方春糜子區(qū)和黃土高原春夏糜子區(qū)歸為一類，材料來自于寧夏回族自治區(qū)、山西省、陜西省、內(nèi)蒙古自治區(qū)、甘肅省、青海省。聚類結(jié)果與遺傳相似性分析結(jié)果一致。

圖3 基于遺傳距離的不同生態(tài)區(qū)糜子資源聚類圖Fig. 3 Cluster diagram of broomcorn millet accessions with different ecotypes based on genetic distance

基于 UPGMA對(duì) 131份糜子材料進(jìn)行聚類分析（圖4），131份糜子材料聚為7個(gè)組群。組群A有30份材料，包括黑龍江省12份、吉林省4份、遼寧省1份、甘肅省2份、山西省3份、陜西省1份、寧夏回族自治區(qū)1份、青海省6份，大部分基因型屬于東北春糜子區(qū)。組群B有7份材料，其中河北省2份、內(nèi)蒙古自治區(qū)2份、寧夏回族自治區(qū)、山東省、陜西省各1份，主要屬于華北夏糜子區(qū)，組群C有3份材料，包括來自山西省的品黍1號(hào)，遼寧省的本溪褐糜子和山西省的灰臉蛋糜，表明這3份材料遺傳背景相似且與其他材料的遺傳差異較大。組群D包括16份材料，其中內(nèi)蒙古自治區(qū)5份、河北省7份、山西省3份、青海省1份，均來自北方春糜子區(qū)。組群E包含3份材料，其中內(nèi)蒙古自治區(qū)2份，陜西省1份。組群F有21份材料，包括山西省5份、陜西省4份、甘肅省2份、新疆維吾爾自治區(qū)2份，寧夏回族自治區(qū)2份、遼寧省1份、吉林省5份，主要屬于黃土高原春夏糜子區(qū)。組群G包含51份材料，包括山西省11份，內(nèi)蒙古自治區(qū)11份，甘肅省8份，寧夏回族自治區(qū)11份、黑龍江省4份，新疆維吾爾自治區(qū)、青海省、陜西省、吉林省、遼寧省、河北省各1份，主要屬于北方春糜子區(qū)和黃土高原春夏糜子區(qū)。

東北春糜子區(qū)的育成品種中，來自黑龍江省的材料主要聚在組群 A中，來自吉林省的材料主要聚在組群F中，東北春糜子區(qū)的農(nóng)家種與育成品種聚類結(jié)果一致。北方春糜子區(qū)的育成品種主要聚在組群 G中，農(nóng)家種主要聚在A、D中，在組群G中也零星出現(xiàn)，其中，來自青海省的農(nóng)家種集中聚在組群 A中。黃土高原春夏糜子區(qū)的育成品種聚在組群A和G中，農(nóng)家種集中聚在組群F中。來自華北夏糜子區(qū)的3份材料全部聚在組群B中。來自西北春夏糜子區(qū)的3份材料，2份聚在組群F中，1份聚在組群G中。來自北方春糜子區(qū)和黃土高原春夏糜子區(qū)的育成品種多數(shù)聚在組群 G中，說明這兩個(gè)生態(tài)區(qū)的部分育成品種遺傳背景相似。農(nóng)家種在各組群中的分布與地理來源密切相關(guān)，部分育成品種的遺傳背景可能包含其他生態(tài)區(qū)的基因型，在各組群中的分布沒有明顯的區(qū)域性。

圖4 基于熒光SSR分子標(biāo)記分析的131份糜子材料聚類圖Fig. 4 Cluster diagram of 131 broomcorn millet accessions based on data from 22 SSR markers

2.5 中國(guó)糜子種質(zhì)資源的群體遺傳結(jié)構(gòu)分析

用STRUCTURE軟件分析來自中國(guó)不同地區(qū)的131份糜子材料，將 K設(shè)為 2—10，繪制 K與 ΔK的關(guān)系圖（圖5），K=4時(shí)，ΔK最大，因此在K=4的模式下分析糜子品種的遺傳結(jié)構(gòu)[30］，并計(jì)算出每個(gè)類群的最大 Q值分布。不同的色塊代表不同的類群（圖6，表4），類群Ⅰ為紅色部分（35份），代表北方春糜子區(qū)，主要包含甘肅省 8份、青海省 7份、內(nèi)蒙古自治區(qū)7份、寧夏回族自治區(qū)6份、山西省3份、黑龍江省3份、陜西省1份。類群Ⅱ?yàn)榫G色部分（21份），包括黑龍江省10份、吉林省3份、山西省3份、甘肅省2份、寧夏回族自治區(qū)、陜西省和遼寧省各1份，主要來自東北春糜子區(qū)。類群Ⅲ為藍(lán)色部分（43份），包括山西省15份、內(nèi)蒙古自治區(qū)9份、河北省6份、寧夏回族自治區(qū)4份、陜西省、黑龍江省、遼寧省各2份、吉林省、新疆維吾爾自治區(qū)、青海省各1份，主要來自北方春糜子區(qū)。群組Ⅳ為黃色部分（32份），包括山西省 6份、陜西省 5份、吉林省 6份、寧夏回族自治區(qū) 4份、河北省 3份、甘肅省、新疆維吾爾自治區(qū)各2份、遼寧省、內(nèi)蒙古自治區(qū)、黑龍江省、山東省各1份，主要來自黃土高原春夏糜子區(qū)。

圖5 131份糜子材料的K值與Δk值的關(guān)系Fig. 5 Graphical relationship between K and Δk for 131 broomcorn millet accessions

圖6 131份糜子材料的群體遺傳結(jié)構(gòu)分析Fig. 6 Population genetic structure of 131 broomcorn millet accessions

表4 131份糜子材料在各組群中的分布（K=4）Table 4 Distribution of 131 broomcorn millet accessions based on STRUCTURE analysis(K=4)

黃土高原春夏糜子區(qū)的育成品種在組群Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ中都有出現(xiàn)，農(nóng)家種集中分布在組群Ⅳ中。北方春糜子區(qū)的育成品種和農(nóng)家種主要分布在組群Ⅰ和組群Ⅲ中，其中來自青海省的農(nóng)家種全部分布在組群Ⅰ中，來自河北省北部的農(nóng)家種分布在組群Ⅲ中，東北春糜子區(qū)的育成品種和農(nóng)家種主要分布在組群Ⅱ和Ⅳ中，其中來自黑龍江省的材料主要分布在組群Ⅱ中，來自吉林省的材料主要分布在組群Ⅳ中，華北夏糜子區(qū)的材料均分布在組群Ⅳ中。西北春夏糜子區(qū)的材料分布在組群Ⅲ和Ⅳ中。遺傳結(jié)構(gòu)分析結(jié)果與聚類結(jié)果基本一致。

STRUCTURE群體結(jié)構(gòu)分析中，當(dāng)某一材料在某類群中的Q≥0.6時(shí)，則認(rèn)為該材料血緣關(guān)系相對(duì)比較單一，否則認(rèn)為該材料血緣關(guān)系來源復(fù)雜[9］。131份糜子材料在各個(gè)群體中的Q值分布見表5，131份糜子材料中有 107個(gè)品種 Q＞0.6，占所有供試材料的81.7%，Q＞0.8和Q＞0.9的品種分別占58%和48.1%，說明各群體中大部分品種親緣關(guān)系比較單一，較少品種含有其他類群的基因成分。品黍1號(hào)在4個(gè)類群中的Q值分別為0.190、0.011、0.453和0.346；本溪褐糜子在4個(gè)類群中的Q值分別為0.074、0.134、0.443和 0.349；灰臉蛋糜在 4個(gè)類群中的 Q值分別為0.047、0.004、0.478和0.471，它們的基因都主要來源于類群Ⅲ和類群Ⅳ中，聚類分析也被單獨(dú)聚為一個(gè)小支，說明這三個(gè)品種的遺傳背景比較相似，與聚類結(jié)果一致。

表5 各群體Q值分布Table 5 Distribution of Q-value of four groups

3 討論

3.1 熒光SSR標(biāo)記分析技術(shù)在糜子上的應(yīng)用

SSR標(biāo)記的檢測(cè)可采用瓊脂糖凝膠電泳、非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳、變性聚丙烯酰胺凝膠電泳和毛細(xì)管電泳熒光檢測(cè)法，因方法不同，結(jié)果也會(huì)有所差別?；谌詣?dòng)基因分析儀的SSR熒光標(biāo)記技術(shù)是用6-FAM、HEX、ROX和TAMRA 4種熒光染料中的一種對(duì)引物進(jìn)行標(biāo)記，擴(kuò)增的PCR產(chǎn)物和標(biāo)準(zhǔn)分子量樣品（內(nèi)標(biāo)）在同一毛細(xì)管泳道中電泳，利用軟件進(jìn)行圖像收集和擴(kuò)增片段的大小分析，實(shí)現(xiàn)了SSR標(biāo)記與高效、自動(dòng)化技術(shù)的結(jié)合，比傳統(tǒng)聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測(cè)技術(shù)準(zhǔn)確性更高，重復(fù)性更好。本試驗(yàn)同時(shí)采用變性聚丙烯酰胺和毛細(xì)管電泳雙向檢測(cè)技術(shù)分析22對(duì)引物在131份糜子材料中的遺傳多樣性，檢測(cè)結(jié)果基本一致。但傳統(tǒng)的變性聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測(cè)技術(shù)在不同板之間數(shù)據(jù)整合比較困難，當(dāng)片段差異較小時(shí)，讀帶也有一定的困難，熒光SSR分子標(biāo)記技術(shù)有效解決了不同板，不同實(shí)驗(yàn)室數(shù)據(jù)整合問題。

本研究所選用的22對(duì)標(biāo)記中，有11對(duì)與連帥等[15］相同，這11對(duì)檢測(cè)出的等位變異數(shù)平均為6.5個(gè)，而連帥用非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測(cè)出的等位變異數(shù)平均為3個(gè)，這說明SSR熒光標(biāo)記檢測(cè)技術(shù)能檢測(cè)到傳統(tǒng)聚丙烯酰胺凝膠電泳發(fā)現(xiàn)不了的等位變異，結(jié)果更加準(zhǔn)確可靠。

3.2 SSR標(biāo)記在糜子種質(zhì)資源遺傳多樣性研究中的應(yīng)用

CHO等[13］基于糜子基因組DNA富集SSR文庫開發(fā)了首批糜子的SSR標(biāo)記，利用25個(gè)標(biāo)記在50份材料中檢測(cè)到110個(gè)等位變異，平均每個(gè)標(biāo)記的等位變異數(shù)為4.4個(gè)，平均PIC為0.33。HUNT等[14］用其中的16個(gè)標(biāo)記檢測(cè)了98份歐亞大陸糜子地方品種的遺傳多樣性，平均每個(gè)位點(diǎn)檢測(cè)到4.9個(gè)等位變異，平均基因多樣性指數(shù)和多態(tài)性信息含量分別為 0.391和0.360。連帥等[15］用63對(duì)引物分析了來自國(guó)內(nèi)外的192份糜子品種的遺傳多樣性，平均每個(gè)SSR位點(diǎn)檢測(cè)到2.56個(gè)等位變異，平均PIC值為0.4855。王瑞云等[24］利用15個(gè)糜子特異性SSR標(biāo)記檢測(cè)來自中國(guó)11個(gè)?。▍^(qū)）的132份糜子材料，平均基因多樣性指數(shù)和多態(tài)性信息含量分別為0.5298和0.4864。本研究選用22對(duì)SSR引物對(duì)131份糜子材料進(jìn)行分析，共檢測(cè)出128個(gè)主要等位變異，平均每個(gè)5.82個(gè)，基因多樣性指數(shù)為 0.3572—0.8132，平均 0.6284；多態(tài)性信息含量為0.2934—0.8150，平均0.5874；Shannon多樣性指數(shù)為0.5427—1.7681，平均1.2062。本試驗(yàn)所用SSR標(biāo)記的多態(tài)性均高于前人研究結(jié)果。一方面本試驗(yàn)的引物經(jīng)過兩次篩選，引物多態(tài)性高，同時(shí)參試材料數(shù)量多、來源廣，遺傳多樣性豐富；另一方面所用的檢測(cè)方法分辨率更高，準(zhǔn)確性更好。這也表明對(duì)已開發(fā)的糜子SSR標(biāo)記進(jìn)行進(jìn)一步篩選的必要性，篩選高多態(tài)性引物用于糜子遺傳多樣性研究和DNA指紋圖譜的構(gòu)建。此外，建立高分辨率且成本較低的分子標(biāo)記檢測(cè)方法對(duì)于促進(jìn)糜子遺傳多樣性研究也具有非常重要的意義。

3.3 中國(guó)糜子種質(zhì)資源的遺傳差異

中國(guó)糜子資源分布廣泛，主要分布在七個(gè)生態(tài)區(qū)，分別為東北春糜子區(qū)、華北夏糜子區(qū)、北方春糜子區(qū)、黃土高原春夏糜子區(qū)、西北春夏糜子區(qū)、青藏高原春糜子區(qū)和南方秋冬糜子區(qū)。不同生態(tài)區(qū)，不同材料間的遺傳多樣性以及遺傳關(guān)系成為近年來糜子研究的熱點(diǎn)。王瑞云等[31］利用高基元微衛(wèi)星標(biāo)記分析了 96份糜子材料的遺傳多樣性并提出黃土高原和北方春糜子區(qū)的遺傳多樣性最豐富。連帥等[15］采用 63對(duì)高多態(tài)性SSR標(biāo)記研究了來自于國(guó)內(nèi)外的192份糜子地方品種和野生材料的遺傳多樣性，并發(fā)現(xiàn)內(nèi)蒙古、東北、黃土高原地區(qū)種質(zhì)資源遺傳關(guān)系較其他地區(qū)更為復(fù)雜。薛延桃等[17］對(duì)近幾年新收集引進(jìn)的國(guó)外糜子地方品種和野生材料共計(jì)146份進(jìn)行分析發(fā)現(xiàn)國(guó)內(nèi)野生材料的遺傳多樣性高于國(guó)外地方品種，且河北群體的遺傳多樣性最為豐富。HU等[2］發(fā)現(xiàn)黃土高原地區(qū)的遺傳多樣性最豐富，可能是糜子的起源中心。董俊麗等[32］對(duì)糜子骨干種質(zhì)進(jìn)行遺傳多樣性分析發(fā)現(xiàn)遺傳多樣性與生態(tài)環(huán)境密切相關(guān)，且山西糜子資源的遺傳多樣性最豐富。本研究分析了來自5個(gè)生態(tài)區(qū)的131份糜子育成品種和農(nóng)家種的遺傳多樣性和群體結(jié)構(gòu)，發(fā)現(xiàn)北方春糜子區(qū)和黃土高原春夏糜子區(qū)的遺傳多樣性最豐富，與王瑞云等[31］結(jié)論一致。通過比較本研究與前人研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)不同結(jié)果之間遺傳差異存在較大差別，究其原因，可能有以下幾個(gè)方面：一是各研究所采用的試驗(yàn)材料種類有所差異，如連帥等[15］和薛延桃等[17］文章中均包含了一定數(shù)量的國(guó)外品種以及國(guó)內(nèi)野生資源，從而造成不同區(qū)域遺傳多樣性有所差異；二是不同研究中對(duì)同一生態(tài)區(qū)的試驗(yàn)材料選擇數(shù)量的差別也會(huì)造成結(jié)果出現(xiàn)差異，如本研究選用北方春糜子區(qū)和黃土高原春夏糜子區(qū)的材料較多，西北春夏糜子區(qū)和南方秋冬糜子區(qū)的材料較少，為更加準(zhǔn)確評(píng)估中國(guó)糜子資源的遺傳多樣性，選材需更加豐富。

群體結(jié)構(gòu)分析結(jié)果表明，甘肅省材料 66.7%集中在群組Ⅰ中，青海省材料 87.5%聚在群組Ⅰ中，黑龍江省材料 66.7%聚在群組Ⅱ中，山西省的材料在各個(gè)組群中均有出現(xiàn)，與聚類結(jié)果基本一致。說明大部分糜子品種的遺傳差異與地理來源相關(guān)，有些品種沒有明顯的區(qū)域特征，可能是不同區(qū)域間品種經(jīng)過多次基因重組所致。

3.4 中國(guó)糜子育成品種和農(nóng)家種的遺傳多樣性比較

國(guó)內(nèi)外對(duì)糜子的遺傳多樣性和群體結(jié)構(gòu)分析有很多[13-18］，但有關(guān)中國(guó)糜子育成品種和農(nóng)家種遺傳差異的相關(guān)報(bào)道并不多見，本研究分析比較了來自中國(guó)不同生態(tài)區(qū)的 72份糜子育成品種及當(dāng)?shù)刂饕r(nóng)家種的遺傳多樣性和群體遺傳結(jié)構(gòu)，發(fā)現(xiàn)北方春糜子區(qū)農(nóng)家種的遺傳多樣性高于育成品種，東北春糜子區(qū)和黃土高原春夏糜子區(qū)農(nóng)家種的遺傳多樣性略低于育成品種。聚類分析和群體結(jié)構(gòu)分析結(jié)果表明，東北春糜子區(qū)的育成品種和農(nóng)家種并不獨(dú)立成群，在各組群中的分布基本一致，這可能因?yàn)槊幼佑善贩N主要以農(nóng)家種為遺傳背景選育而來，而黃土高原春夏糜子區(qū)的育成品種和農(nóng)家種分布在不同的組群中，這說明黃土高原春夏糜子區(qū)在育種過程中引種資源廣泛，有效利用優(yōu)良種質(zhì)用于育種創(chuàng)新。北方春糜子區(qū)的農(nóng)家種具有更高的遺傳多樣性，可為糜子新品種選育過程中挖掘優(yōu)良基因和拓寬遺傳基礎(chǔ)提供重要的利用價(jià)值。

4 結(jié)論

北方春糜子區(qū)和黃土高原春夏糜子區(qū)的遺傳多樣性高于東北春糜子區(qū)，糜子的遺傳差異與地理來源相關(guān)，東北春糜子區(qū)的育成品種主要以農(nóng)家種為遺傳背景選育而來，黃土高原春夏糜子區(qū)在育種過程中引種資源廣泛，與其他生態(tài)區(qū)存在基因交流。