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    擬南芥中一個鋅指蛋白AT 5 g 47610的基因克隆及表達分析

    2019-05-28 03:31:08伍林濤
    種子 2019年4期
    關鍵詞:鋅指泳道泛素

    伍林濤 奉 斌 蔡 菁

    (1.成都師范學院化學與生命科學學院, 成都 611130; 2.四川大學華西藥學院, 成都 610064;3.貴州省農(nóng)業(yè)科學院油菜研究所, 貴陽 550008; 4.貴州省農(nóng)業(yè)科學院油料研究所, 貴陽 550006)

    隨著全球變暖,極端氣候事件發(fā)生日趨頻繁,尤其是高溫干旱等極端氣候事件,近幾十年在我國發(fā)生的頻率和強度增加異常顯著[1]。高溫、干旱等非生物脅迫會引起植物的形態(tài)、生化、生理和分子等方面發(fā)生變化,并導致植物的產(chǎn)量下降[2-4],對農(nóng)業(yè)造成的損害在世界范圍內(nèi)都非常廣泛。

    植物在脅迫條件下,能夠感知并傳導逆境信號,啟動相關基因的表達,從而激活相應的保護代謝途徑,如氣孔關閉、脫落酸(ABA)含量增加、抗氧化酶含量改變等?,F(xiàn)已發(fā)現(xiàn)很多在脅迫應答信號中起作用的基因,一般按功能分為兩類:一類是功能蛋白,包括糖轉(zhuǎn)運子、水通道蛋白、抗凍蛋白和分子伴侶等,能夠直接提高植物的抗逆能力;另一類是調(diào)節(jié)蛋白,包括不同家族的轉(zhuǎn)錄因子、磷酸酶、蛋白激酶和E 3泛素連接酶等,主要參與調(diào)控脅迫的信號轉(zhuǎn)導以及與脅迫相關基因的表達[5-6]。而對調(diào)節(jié)蛋白的研究,以轉(zhuǎn)錄水平調(diào)控居多[7],至于翻譯后水平調(diào)控(主要包括磷酸化和泛素化修飾)機制研究得還不透徹,是目前植物應對脅迫調(diào)控機制研究的熱點內(nèi)容。其中泛素化修飾參與調(diào)控細胞生命活動的各個生理代謝過程,在細胞生命活動中發(fā)揮著至關重要的作用,特別在植物響應外界非生物脅迫的過程是不可缺少的,因此近年來引起了越來越廣泛的關注[8-9]。

    泛素依賴的蛋白酶體途徑由泛素激活酶E 1、泛素結(jié)合酶E 2和泛素連接酶E 3順序催化完成,目前,已發(fā)現(xiàn)了一些泛素E 3連接酶能夠決定靶蛋白的特異性識別,參與植物的逆境脅迫,在泛素途徑中具有重要作用[10-12]。篩選與鑒定擬南芥中與高溫、干旱相關的E 3連接酶,分析其抗逆機制,將有助于通過基因工程手段選育耐熱耐旱的植物新品種,提高高溫干旱地區(qū)的農(nóng)業(yè)生產(chǎn)力,具有重要的現(xiàn)實意義。

    本研究對擬南芥中具有鋅指(RING-finger)結(jié)構,可能具有E 3泛素酶活性,并在耐熱方面起有一定作用的AT 5 g 47610進行了基因克隆及表達分析,為進一步鑒定其功能奠定基礎。

    1 材料與方法

    1.1 實驗材料

    1.1.1植物材料

    野生型擬南芥(Arabidopsisthaliana) Columbia (Col.)生態(tài)型為本實驗室保存。

    1.1.2菌株、載體

    菌株:E.coliJM 109,用于AT5G47610基因載體的構建及克?。籈.coliBL 21:用于原核表達。均為本實驗室保存。載體:PET 32 a,為本實驗室保存。

    1.1.3化學及分子生物學試劑

    高保真Pfu DNA多聚酶、dNTP混合物、限制性內(nèi)切酶(Bam H 1、Sac 1)均購自Fermentas(MBI)公司;T 4 DNA 連接酶、2 000 bp DNA Ladder Marker購自Takara公司;DNA膠回收試劑盒和質(zhì)粒提取試劑盒購自Tiangen公司。

    1.2 實驗方法

    1.2.1引物設計

    根據(jù)在NCBI上查到的AT 5 G 47610的cDNA序列,使用primer 5.0設計引物。引物序列為:

    UP:5’CGGGATCCAAGATGCGTTTGCTAGTAGCAG 3’

    down:5’CGAGCTCGTGGCTTGAAGGAGTTTCAGAGT 3’

    1.2.2RNA提取及反轉(zhuǎn)錄為cDNA

    參照張年輝[13]的方法稍作改動提取擬南芥總RNA,利用RT-PCR制備擬南芥cDNA,反應體系(20μL):

    反應體系反應體積/μL5×RT buffer4dNTP2Super RI0.5RT-Enhancer0.5Random Primer1Oligo dT1模板(RNA)4Rever Ace1ddH2O6

    反應程序:30 ℃,10 min;42 ℃,30 min;99 ℃,5 min;4 ℃,5 min。

    1.2.3AT 5 G 47610基因的擴增和純化

    以擬南芥cDNA為模板,構建PCR反應體系(25μL):

    反應體系反應體積/μL10×pfu Buffer(含MgSO4)2 .5dNTP2Up Primer1Dn Primer1模板(cDNA)2Taq 酶(5U·μL-1)0.5ddH2O16

    PCR循環(huán)參數(shù):94 ℃變性2 min;然后進行31個PCR循環(huán)(94 ℃變性30 s,54 ℃退火30 s,72 ℃延伸50 s);最后繼續(xù)在72 ℃延伸10 min,16 ℃保存。PCR結(jié)束后,將擴增產(chǎn)物進行2% 瓊脂糖凝膠電泳,5 V·cm-1電泳18 min后,放入凝膠成像系統(tǒng)中觀察是否有目標條帶。

    按上述已摸索好的反應條件配制10組相同的PCR體系,擴增后將10組合為一管用于后續(xù)的純化。配制大孔的2%瓊脂糖凝膠用于膠回收。從瓊脂糖凝膠上切下含目的基因片段的凝膠,按照Tiangen公司通用型DNA純化回收試劑盒(Universal DNA Purification Kit)操作步驟純化回收擴增產(chǎn)物。

    1.2.4載體片段連接體系的構建

    AT5G47610基因的克隆以PET 32 a克隆載體進行。將載體PET 32 a進行Bam H 1 和Sac 1雙酶切,與AT5G47610基因酶切片段進行連接。使用T 4 DNA連接酶的連接體系(10μL)為:

    反應體系反應體積/μL10×Buffer1雙酶切純化AT5G47610基因片段2雙酶切PET32載體片段4T4 DNA連接酶1ddH2O2

    16 ℃水浴過夜16 h。

    1.2.5連接產(chǎn)物的轉(zhuǎn)化

    1) 自-80 ℃中取出感受態(tài)細胞JM 109,放置于冰上至完全溶解。

    2) 取5μLAT5G47610基因片段與PET 32 a的連接產(chǎn)物與50μL感受態(tài)細胞混勻,冰浴30 min。

    3) 42 ℃熱沖擊45 s,冰浴靜置5 min。

    4) 加入800μL LB,37 ℃緩慢振搖1 h。

    5) 5 000 r·min-1離心5 min,吸去部分上清,余下50μL上清懸浮菌體,涂布于含50μg·mL-1Amp的LB固體平板上,37 ℃倒置培養(yǎng)18 h。

    1.2.6表達菌株的制備及目標蛋白的誘導表達與檢測

    挑選邊緣光滑,大小均一的單菌落為模板進行菌落PCR,找到陽性菌落。將菌落PCR陽性單菌落保存并擴大培養(yǎng),送上海Invitrogen生物工程公司進行序列測定,收到測序結(jié)果后,與在NCBI上查詢的原始序列對比,進一步確定陽性結(jié)果的真實性。提取重組質(zhì)粒, 然后轉(zhuǎn)化感受態(tài)細胞BL 21。低溫搖床誘導表達目標蛋白[14],并進行SDS-Page 蛋白表達檢測。

    2 結(jié)果與分析

    2.1 擬南芥RNA的提取

    RNA的質(zhì)量直接影響后續(xù)實驗,由圖1的電泳結(jié)果可以看到,一個泳道共出現(xiàn)了3條條帶:28 S、18 S、5 S。3條條帶很清晰,沒有拖帶,說明RNA基本沒有降解,提取質(zhì)量良好,RNA可用于后續(xù)實驗。

    圖1 擬南芥總RNA提取凝膠電泳圖

    2.2 目標基因AT5G47610的PCR擴增

    以擬南芥cDNA為模板,用已設計好的帶有酶切位點(Bam H 1和Sac 1)的目的基因的引物進行PCR擴增,并膠回收結(jié)果如圖2,可以看到在Marker 560 bp位置有明亮的目標條帶,通過灰度值計算其濃度進行下一步的實驗。

    圖2 AT5G47610基因膠回收后的電泳結(jié)果

    2.3 載體片段連接體系檢測

    如圖3所示,a、b泳道為Bam H 1 和Sac 1雙酶切后產(chǎn)物,b泳道雙酶切獲得的2條條帶說明AT5G47610基因已成功連接到克隆載體PET 32 a中。

    圖3 載體片段連接體系酶切結(jié)果

    2.4 目標基因蛋白的誘導表達

    表達菌株經(jīng)IPTG誘導蛋白表達,收集菌體制樣后,SDS-PAGE電泳結(jié)果如圖4。對比未添加IPTG的實驗組,可以看到添加IPTG的實驗組在40 KD蛋白Marker處均有蛋白的表達,但由于IPTG添加比例不同,目標蛋白亮度不一致。0.2 mM IPTG是最為合適的誘導濃度。

    注:a—泳道無IPTG;b—泳道0.4 mM IPTG;c—泳道0.3 mM IPTG;d—泳道0.2 mM IPTG;e—泳道0.1 mM IPTG;f—泳道0.05 mM IPTG。圖4 AT 5 g 47610蛋白表達SDS-PAGE結(jié)果

    3 討 論

    本課題組在前期研究發(fā)現(xiàn)了一個具有鋅指結(jié)構的AT 5 g 47610蛋白,而它的同源蛋白AT 2 g 02960(ATPRF 1)經(jīng)體外泛素化實驗驗證,為一個E 3連接酶[15],另2個同源蛋白AT 5 g 43200(AtHHR 2)[16]和AT 5 g 43420(ATL 16)[17]也被證實具有E 3連接酶的功能。因此猜測同樣具有鋅指結(jié)構的AT 5 g 47610蛋白也同樣具有E 3連接酶的功能。為此,本研究進行了AT5G47610目的基因的克隆和表達載體的構建,并成功誘導了目標蛋白的表達,為后續(xù)鑒定AT 5 g 47610蛋白的E 3連接酶活性與奠定基礎。

    E 3連接酶是一種與抗逆相關的泛素連接酶。根據(jù)結(jié)構與功能機制,E 3連接酶家族主要有三大類[18]:HECT家族,U-box蛋白家族和RING-finger(鋅指)家族。其中RING-finger 家族的E 3 連接酶發(fā)現(xiàn)較晚,但其種類龐大且功能復雜,成為近年來研究的熱點。Ryu等在篩選擬南芥ABA不敏感突變體的過程中鑒定出AtAIRP1,它能夠編碼一個鋅指類型泛素E 3連接酶[19]。Ding等發(fā)現(xiàn),擬南芥里面一個鋅指蛋白CHYR 1,具有E 3連接酶的活性,能夠提高植物的耐旱性,而其活性是通過被蛋白激酶SnRK 2.6磷酸化來調(diào)控的[20]。Park等從延遲萌發(fā)的水稻T-DNA突變體中鑒定出一個RING-finger類型泛素E 3連接酶OsDSG 1,發(fā)現(xiàn)與野生型相比,osdsg1突變體對干旱的耐受性增強,一系列ABA信號通路相關及響應的基因和都能夠在突變體中被誘導表達,說明OsDSG 1是依賴于ABA信號轉(zhuǎn)導的干旱脅迫響應的負調(diào)節(jié)子[21]。

    篩選與鑒定擬南芥中同抗逆境相關的E 3連接酶,分析其抗逆機制,再通過基因工程的手段,將相關的E 3連接酶基因?qū)氲狡渌r(nóng)作物當中,將有助于獲得抗逆的新品種,從而實現(xiàn)傳統(tǒng)育種模式的新改革。

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