TTC法快速測(cè)定芍藥種子生活力

(中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院特產(chǎn)研究所，吉林 長春 130112)

芍藥(PaeonialactifloraPall.)是芍藥科芍藥屬多年生草本植物[1]，與牡丹并稱為姐妹花，被世人尊稱為“花相”，觀賞價(jià)值極高[2]，其根部入藥，可以加工成赤芍或白芍，赤芍具有清熱解毒和散瘀止痛的功效，白芍具有平肝止痛、養(yǎng)血調(diào)經(jīng)和斂陰止汗的功效[3]。芍藥的繁殖方式有分株法和種子繁殖法[4]，芍藥種子具有上下胚軸雙重休眠特性[5]，萌發(fā)時(shí)必須先打破下胚軸休眠再打破上胚軸休眠，種子才能萌發(fā)[6]。種子15 ℃沙藏層積45 d后，種子裂口露白打破下胚軸休眠，15 ℃沙藏層積122 d后，根長達(dá)到3～4 cm轉(zhuǎn)為4 ℃低溫層積，28 d后打破上胚軸休眠[7]，打破上下胚軸休眠而萌發(fā)需要5個(gè)月時(shí)間，無法快速測(cè)定種子發(fā)芽率。TTC染色法是《國際種子檢驗(yàn)規(guī)程》中用于測(cè)定種子生活力、判斷種子發(fā)芽潛力的一種有效方法[8]，具有快速、有效、準(zhǔn)確的特點(diǎn)。用種子生活力預(yù)測(cè)發(fā)芽率是芍藥生產(chǎn)中迫切需要解決的技術(shù)。本研究通過正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)，分析各個(gè)因素對(duì)芍藥種子生活力測(cè)定值的影響，以期找到TTC染色最佳條件，實(shí)現(xiàn)種子活力的快速測(cè)定，為芍藥種子質(zhì)量檢測(cè)提供技術(shù)支撐。

1 試驗(yàn)材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

試驗(yàn)所用的芍藥種子于2017年8月初購自遼寧省撫順市東洲區(qū)哈達(dá)鎮(zhèn)，經(jīng)中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院特產(chǎn)研究所郭靖副研究員鑒定為芍藥種子，保存于4 ℃冰箱內(nèi)備用。

1.2 發(fā)芽率測(cè)定

供試的芍藥種子用流水沖洗干凈后，用0.5%的高錳酸鉀溶液消毒40 min，再用蒸餾水沖洗干凈。將消毒后的種子放入100 mg/L GA3溶液中，置于45 ℃恒溫箱避光浸種48 h后，將種子埋入消毒過的沙子中，于室溫條件下進(jìn)行保濕催芽。經(jīng)常檢查種子發(fā)芽情況，以胚根突破種皮2 mm 以上為發(fā)芽的標(biāo)準(zhǔn)。從發(fā)芽開始每隔5 d統(tǒng)計(jì)1次發(fā)芽情況，連續(xù)10 d沒有新發(fā)芽的種子視為發(fā)芽結(jié)束[4，7,9-10]。

1.3 TTC染色方法

1.3.1正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)

采取L16(45)5因素4水平正交試驗(yàn)，設(shè)置(表1)，以浸種溫度、浸種時(shí)間、TTC濃度、染色溫度及染色時(shí)間5個(gè)直接影響種子生活力測(cè)定的因素作為檢測(cè)指標(biāo)，并設(shè)置4個(gè)不同的水平，進(jìn)行正交試驗(yàn)。

表1 正交設(shè)計(jì)因素水平

水平試驗(yàn)因素A 浸種溫度(℃)B 浸種時(shí)間(h)C TTC濃度(%)D 染色溫度(℃)E 染色時(shí)間(h)12560.1256230120.33012335180.535184402414024

1.3.2TTC染色試劑的配制

磷酸緩沖溶液的配制：溶液甲，稱取7.802 5 g NaH2PO4·2 H2O 溶解于500 mL雙蒸水中；溶液乙，稱取17.91 g Na2HPO4·12 H2O 溶解于500 mL雙蒸水中。取195 mL 溶液甲和305 mL 溶液乙混合即成。

不同濃度 TTC 溶液配制[8]： 0.1% TTC 溶液配制，稱取0.1 g氯化四唑粉劑溶解于100 mL磷酸緩沖溶液，按此法分別配制0.1%、0.3%、0.5%、1.0% TTC溶液，于棕色瓶中4 ℃冰箱避光保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.3浸種處理

將芍藥種子置于三角瓶中，加入雙蒸水至完全浸沒種子，每份加入等量雙蒸水，分別置于25，30，35 ℃和40 ℃的恒溫箱內(nèi)浸泡處理6，12，18 h和24 h，使種子充分吸水。每個(gè)處理組合種子30粒，重復(fù)3次。

1.3.4染色前的準(zhǔn)備

取出浸泡后的種子，用濾紙吸干種子表面的水分，用解剖刀將種子沿種臍縱切，以不損傷胚為佳，選取保留胚的一半種子，置于染色盤內(nèi)備用。

1.3.5染 色

將等量濃度為0.1%、0.3%、0.5%、1.0%的TTC溶液分別加入不同的染色盤內(nèi)，至芍藥種子完全浸沒。之后，將染色盤分別置于25，30，35，40 ℃的恒溫箱內(nèi)避光染色，并分別于6，12，18，24 h后取出，倒出TTC溶液，用雙蒸水沖洗種子3次，再用濾紙吸干將種子表面的水分。

1.3.6染色后觀察

在40倍解剖鏡下觀察胚和胚乳的染色效果，并記錄染色情況。判斷種子是否有生活力的標(biāo)準(zhǔn)為：胚及胚乳全部染色、胚全部染色但是胚乳20%未染色的種子為有生活力的種子；胚及胚乳未染色、胚未染色但胚乳大部分染色、胚染色但胚乳未染色的種子為無生活力的種子[7]。

1.4 數(shù)據(jù)處理

采用統(tǒng)計(jì)分析軟件SAS 9.2對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，篩選TTC法測(cè)定芍藥種子生活力最佳條件。

種子生活力(%)=(有生活力的種子數(shù)/供試種子總數(shù))×100%；

種子發(fā)芽率(%)=(發(fā)芽種子數(shù)/供試種子總數(shù))×100%。

2 結(jié)果與分析

2.1 種子發(fā)芽率測(cè)定結(jié)果

發(fā)芽試驗(yàn)結(jié)束后，統(tǒng)計(jì)芍藥種子4次重復(fù)發(fā)芽數(shù)目分別為30、29、30、30粒，發(fā)芽率平均值為99.17%。

2.2 種子生活力測(cè)定正交試驗(yàn)結(jié)果

采用TTC染色測(cè)定芍藥種子生活力正交試驗(yàn)結(jié)果見表2。種子生活力最高為100%，相應(yīng)的處理組合為處理組合2(25 ℃浸種12 h、0.3%TTC濃度30 ℃避光染色12 h)和處理組合12(35 ℃浸種24 h、0.3%TTC濃度25 ℃避光染色18 h)，生活力測(cè)定值最低為處理組合1，即25 ℃浸種6 h、0.1%TTC濃度25 ℃避光染色6 h，該組合染色效果差，芍藥種子染成淡粉色或不染色。

2.3 極差分析

比較各因素對(duì)芍藥種子活力的影響，對(duì)所得正交試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行極差分析(見表2)，極差值R 1=83.33，R 2=111.12，R 3=108.89，R 4=92.22，R 5=110.00。5個(gè)因素對(duì)芍藥種子生活力的影響大小依次為：浸種時(shí)間>染色時(shí)間>TTC濃度>染色溫度>浸種溫度，即染色時(shí)間對(duì)芍藥種子生活力測(cè)定值影響最大，其次是浸種時(shí)間和TTC濃度，而染色溫度和浸種溫度的影響相對(duì)較小。

進(jìn)一步通過Ⅰj、Ⅱj、Ⅲj、Ⅳj進(jìn)行分析，挑選因素所對(duì)應(yīng)的最大值來代表適合測(cè)定芍藥種子生活力條件。浸種溫度(因素A)：Ⅰ1、Ⅱ1、Ⅲ1、Ⅳ1中Ⅱ1值最大，浸種溫度可以選30 ℃；浸種時(shí)間(因素B)：Ⅰ2、Ⅱ2、Ⅲ2、Ⅳ2中Ⅳ2值最大，Ⅳ2=392.23，Ⅱ2=380.01，二者相差12.22，差異不大，可以將浸種時(shí)間從24 h降為12 h；TTC濃度(因素C)：Ⅰ3、Ⅱ3、Ⅲ3、Ⅳ3中Ⅲ3值最大,Ⅲ3=388.90，Ⅱ3=378.89，二者相差10.01，差異不大，可以將TTC濃度從0.5%降為0.3%；染色溫度(因素D)：Ⅰ4、Ⅱ4、Ⅲ4、Ⅳ4中Ⅱ4值最大；染色時(shí)間(因素E)：Ⅰ5、Ⅱ5、Ⅲ5、Ⅳ5中Ⅱ5值最大。綜上可得出A2B2C2D2E2為較優(yōu)組合，即芍藥種子30 ℃浸種12 h，30 ℃條件下0.3%TTC溶液避光染色12 h。

表2 TTC法測(cè)定種子生活力的正交試驗(yàn)結(jié)果

處理組合因素 A因素 B因素 C因素 D因素 E平均生活力1A1(25)B1(6)C1(0.1)D1(25)E1(6)0.00±0.00e2A1(25)B2(12)C2(0.3)D2(30)E2(12)100.00±0.00a3A1(25)B3(18)C3(0.5)D3(35)E3(18)95.56±1.11abc4A1(25)B4(24)C4(1)D4(40)E4(24)97.78±1.11ab5A2(30)B1(6)C2(0.3)D3(35)E4(24)91.11±2.22cd6A2(30)B2(12)C1(0.1)D4(40)E3(18)95.56±1.11abc7A2(30)B3(18)C4(1)D1(25)E2(12)91.11±2.22cd8A2(30)B4(24)C3(0.5)D2(30)E1(6)98.89±1.11ab9A3(35)B1(6)C3(0.5)D4(40)E2(12)97.78±1.11ab10A3(35)B2(12)C4(1)D3(35)E1(6)87.78±2.22d11A3(35)B3(18)C1(0.1)D2(30)E4(24)88.89±2.22d12A3(35)B4(24)C2(0.3)D1(25)E3(18)100.00±0.00a13A4(40)B1(6)C4(1)D2(30)E3(18)92.22±2.94bcd14A4(40)B2(12)C3(0.5)D1(25)E4(24)96.67±3.33abc15A4(40)B3(18)C2(0.3)D4(40)E1(6)87.78±1.11d16A4(40)B4(24)C1(0.1)D3(35)E2(12)95.56±1.11abcⅠj293.34 281.11 280.01 287.78 274.45 Ⅱj376.67 380.01 378.89 380.00 384.45 Ⅲj374.45 363.34 388.90 370.01 383.34 Ⅳj372.23 392.23 368.89 378.90 374.45 Rj83.33 111.12 108.89 92.22 110.00

注：表中同列不同小寫字母表示p<0.05差異顯著；數(shù)據(jù)表示平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤差。

2.4 方差分析

對(duì)正交試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行方差分析得到表3，試驗(yàn)設(shè)定的5個(gè)因素中都對(duì)試驗(yàn)結(jié)果具有顯著的影響，且影響達(dá)到極顯著差異水平(p<0.01)，即浸種溫度、浸種時(shí)間、TTC濃度、染色溫度和染色時(shí)間對(duì)TTC染色測(cè)定芍藥種子生活力值都起主要作用。

3 結(jié)論與討論

3.1 TTC法測(cè)定芍藥種子生活力的最佳條件

本研究發(fā)現(xiàn)，生活力達(dá)到100%的處理組合分別為處理組合2和處理組合12，該2個(gè)處理組合染色效果較好呈均勻的鮮紅色，從染色效果、節(jié)約時(shí)間、節(jié)約試劑以及減少TTC溶液帶來的環(huán)境污染4個(gè)角度出發(fā)[11-13]，處理組合2較為適宜，即25 ℃浸種12 h、0.3%TTC濃度30 ℃避光染色12 h。經(jīng)過進(jìn)一步分析得出，30 ℃浸種12 h，0.3%TTC溶液30 ℃避光染色12 h為較優(yōu)組合，該組合比處理組合2除了浸種溫度不同，其他各個(gè)條件都相同，前者的浸種溫度為30 ℃，后者的浸種溫度為25 ℃，通過比較Ⅰ1=293.34、Ⅱ1=376.67，二者相差83.33，差異較大，浸種溫度應(yīng)選擇30 ℃。綜上所述，芍藥種子TTC染色的最佳條件為A2B2C2D2E2，即芍藥種子30 ℃浸種12 h后，0.3%TTC溶液30 ℃避光染色12 h。

表3 方差分析

方差來源自由度平方和均方F值顯著性浸種溫度(A)33707.991236.00136.24**浸種時(shí)間(B)35652.601884.20207.70**TTC濃度(C)35650.621883.54207.62**染色溫度(D)34453.071484.36163.62**染色時(shí)間(E)36400.742133.58235.19**誤差30272.169.07

注：R2=0.99,“**”表示在0.01水平上具有極顯著差異。

3.2 TTC法測(cè)定芍藥種子生活力的可行性

本研究所選用的實(shí)驗(yàn)材料為新采收的芍藥種子，測(cè)得種子發(fā)芽率為99.17%，生活力為100%，其生活力略高于發(fā)芽率。同一種子樣品中，種子生活力應(yīng)該大于或者等于發(fā)芽率[14]。TTC染色法是目前國際公認(rèn)測(cè)定種子生活力的方法，可以用來估測(cè)種子潛在的發(fā)芽能力[15-16]。采用TTC法測(cè)定芍藥種子的生活力時(shí)，浸種時(shí)間加上染色時(shí)間僅需24 h，而常規(guī)發(fā)芽試驗(yàn)需要5個(gè)月，因此當(dāng)生產(chǎn)中急需了解芍藥種子質(zhì)量時(shí)，可先用TTC染色法測(cè)定種子的生活力來判斷種子潛在的發(fā)芽能力[17]。本研究結(jié)果表明,TTC染色法測(cè)定芍藥種子生活力具有可行性，在生產(chǎn)實(shí)踐中有一定的應(yīng)用價(jià)值。