火龍果miRNA表達(dá)分析的qRT-PCR檢測體系建立

(貴州大學(xué)農(nóng)業(yè)生物工程研究院/生命科學(xué)學(xué)院，山地植物資源保護(hù)與保護(hù)種質(zhì)創(chuàng)新教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，貴陽 550025)

MicroRNA(miRNA)是由19～25個(gè)核苷酸組成的非編碼單鏈小RNA[1-2]，通過堿基互補(bǔ)配對(duì)切割靶基因、抑制翻譯、介導(dǎo)DNA甲基化等過程實(shí)現(xiàn)調(diào)控功能[3]，參與植物形態(tài)建成、激素應(yīng)答和逆境脅迫等生物學(xué)過程[4-6]。近年來，如何精準(zhǔn)檢測miRNA是否表達(dá)及表達(dá)量成為研究重點(diǎn)，目前的檢測方法主要有原位雜交、Northern blot和qRT-PCR等，其中qRT-PCR以其靈敏度高、特異性強(qiáng)、操作簡便等優(yōu)勢，已成為基因檢測的首選方法[7]。由于長度短小，miRNA的qRT-PCR與普通PCR不同，前者需延長待測miRNA的長度，構(gòu)建出足夠長的PCR模板。目前，基于莖環(huán)法[8]和多腺苷酸聚合酶加尾法(poly A polymerase，PAP)[9]設(shè)計(jì)特異引物，采用qRT-PCR技術(shù)成為miRNA的常用檢測方法。同時(shí)，由于RNA數(shù)量和質(zhì)量等因素可能會(huì)影響miRNA的檢測效果，常規(guī)qRT-PCR的內(nèi)參基因不適合miRNA檢測[10]。因此，特異引物的設(shè)計(jì)和內(nèi)參基因的選擇成為植物miRNA檢測的關(guān)鍵。

貴州屬南亞熱帶和中亞熱帶氣候，在喀斯特高溫干旱地區(qū)火龍果已成為新、特、優(yōu)農(nóng)業(yè)項(xiàng)目[11]?；瘕埞哂休^強(qiáng)的抗逆性且易于栽培等特性[12-15]，在生產(chǎn)上有廣闊的發(fā)展前景。為進(jìn)一步從非編碼基因方向理解火龍果抗逆分子機(jī)理，本課題組在前期進(jìn)行了干旱脅迫下火龍果小RNA組測序，獲得了大量miRNA序列。迄今，尚未有文獻(xiàn)報(bào)道關(guān)于火龍果miRNA的qRT-PCR檢測。因此，火龍果miRNA內(nèi)參基因的篩選及qRT-PCR檢測體系的建立亟待解決。從小RNA組測序結(jié)果中選取了干旱脅迫下差異顯著表達(dá)的miR 396 b，分別使用莖環(huán)和PAP加尾qRT-PCR法檢測miR 396 b在火龍果不同組織及干旱(15%PEG)脅迫下的表達(dá)情況，通過特異性、靈敏度及檢測通量等方面對(duì)此2種方法進(jìn)行綜合比較，并對(duì)常用的內(nèi)參基因5 S和U 6進(jìn)行穩(wěn)定性比對(duì)，旨在建立火龍果miRNA的qRT-PCR檢測體系，為開展火龍果相關(guān)miRNA的研究奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料及干旱處理

火龍果根、莖、果實(shí)采自貴州羅甸新中盛火龍果基地，干旱處理材料取自貴州大學(xué)農(nóng)業(yè)生物工程研究院科研溫室，選長勢一致的“紫紅龍”組培苗在1/2 MS液體培養(yǎng)基中預(yù)培養(yǎng)1周，然后轉(zhuǎn)移到含15%PEG-8000的1/2 MS液體培養(yǎng)基，實(shí)施人工誘導(dǎo)干旱脅迫處理0，2，8 h和20 h，以同期未處理材料為對(duì)照，取3個(gè)生物學(xué)重復(fù)材料，用液氮迅速冷凍后于-80 ℃保存。qRT-PCR相關(guān)引物由上海生物工程有限公司合成，序列見表 1。

表1 火龍果miR 396 b實(shí)時(shí)定量PCR引物序列

名稱引物引物序列(5’→3’)miR396bStem loop RTGTCGTATCCAGTGCAGGGTCCGAGGTATTCGCACTGGATACGACTTCAAGAForwardCGGCGGTTCCACAGCTTTCTReversalGTGCAGGGTCCGAGGT5SForwardGGATGGGTGACCTCCCGGGAAGTCCReversalCGCTTAACTGCGGAGTTCTGATGGGU6ForwardGGGGACATCCGATAAAATTGGReversalGATTTGTGCGTGTCATCCTTG

注：劃線部分為與miR 396 b的3’端互補(bǔ)部分。

1.2 總RNA提取及cDNA合成

分別取根、莖、果實(shí)及干旱處理后的幼莖，采用miRcute miRNA 提取分離試劑盒(Tiangen，北京)提取總RNA；RNA濃度及純度用Thermo NanoDrop 2000酶標(biāo)儀(Thermo Fisher，美國)測定；完整性用2%的瓊脂糖凝膠電泳檢測。

莖環(huán)法、PAP加尾法反轉(zhuǎn)錄體系及反應(yīng)程序分別按照試劑盒說明書(Thermo Fisher，美國)、miRcute增強(qiáng)型miRNA c DNA第一鏈合成試劑盒(Tiangen，北京)進(jìn)行。

1.3 相關(guān)指標(biāo)檢測

通過熒光染料SYBR Green I qRT-PCR檢測miR 396 b、5 S及U 6相關(guān)指標(biāo)。莖環(huán)法定量反應(yīng)體系為：2×Taq SYBR Green PCR Mix 5μL，F(xiàn)、R Primer(10μM)各 0.5μL、cDNA 1μL、ddH2O補(bǔ)至10μL。反應(yīng)程序：95 ℃ 5 min；95 ℃ 30 s，60 ℃ 30 s，35個(gè)循環(huán)；PAP加尾法定量反應(yīng)程序及體系參照miRcute增強(qiáng)型miRNA熒光定量檢測試劑盒(Tiangen，北京)。

由引物擴(kuò)增效率及熔解曲線確定qRT-PCR的特異性，擴(kuò)增效率在90%～110%之間，同時(shí)熔解曲線為特異單峰；比較莖環(huán)法和PAP加尾法靈敏度，取火龍果幼嫩莖RNA逆轉(zhuǎn)錄合成的cDNA按10倍比依次稀釋，最終稀釋107倍，檢測火龍果miR 396 b能檢測到Ct值的最大稀釋比例；比較5 S和U 6作為內(nèi)參基因時(shí)的穩(wěn)定性。

1.4 莖環(huán)法檢測火龍果miR 396 b表達(dá)情況

采用莖環(huán)法qRT-PCR檢測火龍果 miR 396 b在不同組織及干旱脅迫下的表達(dá)情況，反應(yīng)體系及程序同1.3，結(jié)果用2-△△CT法分析，差異顯著性利用SPSS 21.0軟件進(jìn)行單因素方差分析，以p<0.05作為差異顯著性判斷標(biāo)準(zhǔn)。

2 結(jié)果與分析

2.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制及靈敏度分析

將火龍果肉質(zhì)莖RNA分別使用莖環(huán)法和加尾法逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA，以同—cDNA為模板，分別以10倍比稀釋cDNA，熒光染料SYBR Green I qRT-PCR檢測miR 396 b，設(shè)置3個(gè)復(fù)孔。結(jié)果顯示，加尾法和莖環(huán)法分別在cDNA稀釋106倍和107倍后檢測不到Ct值(表2)。莖環(huán)法、加尾法能檢測到miR 396 b的RNA最低濃度分別為138.9×10-5ng/μL、138.9×10-4ng/μL。與加尾法相比，莖環(huán)法檢測miR 396 b靈敏度增加了10倍。由此，莖環(huán)法在檢測靈敏度上優(yōu)于加尾法。

莖環(huán)法檢測miR 396 b時(shí)Ct值在 21.31±0.26間，擴(kuò)增效率為113.24%；而加尾法檢測時(shí)Ct值在24.95±0.25之間，擴(kuò)增效率為134.03%。加尾法比莖環(huán)法高出約3個(gè)Ct值、擴(kuò)增效率高出約21%(表2、圖1)。

圖1 miR 396 b莖環(huán)法(A)與加尾法(B)qRT-PCR標(biāo)準(zhǔn)曲線

注：莖環(huán)法(A)與加尾法(B)實(shí)時(shí)定量 PCR 法產(chǎn)物溶解曲線峰圖；橫線為檢測基線。圖2 Bio-Rad CFX manager軟件檢測hpo-miR 396 b溶解曲線分析圖

c DNA稀釋倍數(shù)莖環(huán)法加尾法021.31±0.2624.95±0.2510-124.21±0.1025.77±0.1310-227.92±0.2229.90±0.0810-330.09±0.1530.83±0.0510-433.94±0.1934.67±0.3110-536.95±0.2938.38±0.4810-639.19±0.37—10-7——

注：“—”表示未檢測出Ct值。

2.2 引物特異性分析

采用莖環(huán)法和加尾法檢測火龍果miR 396 b表達(dá)量，結(jié)果顯示，加尾法溶解曲線在主峰前出現(xiàn)了小峰(圖2 B)，說明PCR過程中存在非特異擴(kuò)增；莖環(huán)法溶解曲線為單峰(圖2 A)，說明PCR產(chǎn)物單一，引物特異性好。由此，莖環(huán)法在特異性上優(yōu)于加尾法。

2.3 莖環(huán)法與PAP法綜合比較

根據(jù)MIQE實(shí)時(shí)熒光定量PCR國際化標(biāo)準(zhǔn)，無論是莖環(huán)法還是加尾法檢測miRNA的表達(dá)量，其標(biāo)準(zhǔn)曲線的相關(guān)系數(shù)(R2)大于0.98，越接近1，結(jié)果可信度越高；擴(kuò)增效率(En)在0.9～1.1間，越接近1，越理想。本試驗(yàn)結(jié)果顯示，用莖環(huán)法檢測火龍果miR 396 b其標(biāo)準(zhǔn)曲線R2為0.996 5、En為113.24%；加尾法檢測其標(biāo)準(zhǔn)曲線R2為0.966 7、En為134.03%(圖1)，顯然，莖環(huán)法檢測火龍果miRNA的表達(dá)結(jié)果更準(zhǔn)確。雖然加尾法RT-PCR實(shí)驗(yàn)所用時(shí)間短，其在檢測通量、反轉(zhuǎn)錄準(zhǔn)確性上都優(yōu)于莖環(huán)法(表3)，但是定量試驗(yàn)對(duì)特異性、靈敏度要求較高，這一點(diǎn)莖環(huán)法更具優(yōu)勢。綜上比較，莖環(huán)法更適用于火龍果miRNA表達(dá)分析的qRT-PCR檢測。

2.4 內(nèi)參基因5 S和U 6穩(wěn)定性比較

以火龍果的莖、根、果實(shí)及干旱處理下的莖為試材，分別檢測內(nèi)參基因5 S和U 6的穩(wěn)定性。結(jié)果表明，5 S作為內(nèi)參時(shí)Ct值范圍為19.85～21.42，擴(kuò)增效率為109.18%；U 6作為內(nèi)參時(shí)Ct值的范圍是18.18～19.37，擴(kuò)增效率為114.7%。本試驗(yàn)結(jié)果表明，U 6的Ct值比較一致，更適合作為龍果miRNA的內(nèi)參基因(表4，圖3)。

2.5 miR 396 b在不同組織及干旱脅迫下的表達(dá)分析

以U 6為內(nèi)參，用莖環(huán)法qRT-PCR檢測miR 396 b在火龍果中的表達(dá)情況。結(jié)果顯示，miR 396 b在火龍果不同組織中均有表達(dá)(圖4 A)。以莖為對(duì)照，miR 396 b

圖3 內(nèi)參基因5 S(A)、U 6(B)qRT-PCR標(biāo)準(zhǔn)曲線

注：“*”表示在p<0.05水平上差異顯著，“**”表示在p<0.01水平上，差異極顯著。圖4 火龍果miR 396 b在不同組織(A)及干旱脅迫下(B)的相對(duì)表達(dá)情況

表3 莖環(huán)法與PAP法qRT-PCR綜合比較

莖環(huán)法反轉(zhuǎn)錄加尾法反轉(zhuǎn)錄檢測通量一次反轉(zhuǎn)錄只能檢測1個(gè)miRNA一次反轉(zhuǎn)錄可檢測多個(gè)miRNA反轉(zhuǎn)錄準(zhǔn)確性內(nèi)參與miRNA分開,在2個(gè)體系分別反轉(zhuǎn)錄,容易產(chǎn)生誤差內(nèi)參與miRNA一起,在同1個(gè)反應(yīng)體系反轉(zhuǎn)錄,準(zhǔn)確性高檢測特異性☆☆☆☆☆☆☆☆☆檢測靈敏度☆☆☆☆☆☆☆☆☆實(shí)驗(yàn)時(shí)間+++++++++

注：“☆”越多表示特異性、靈敏度越高；“+”越多表示實(shí)驗(yàn)所用時(shí)間越多。

在火龍果根中幾乎不表達(dá)，在果實(shí)中的表達(dá)量約是莖中的26倍，達(dá)到極顯著水平(p<0.01)，表明hpo-miR 396 b可能參與調(diào)控火龍果生長發(fā)育。

在干旱脅迫下miR 396 b的表達(dá)呈下調(diào)趨勢(圖4 B)，處理2、8 h后差異不顯著(p>0.05)，而處理20 h后的差異達(dá)到顯著水平(p<0.05)。與0 h相比，在處理20 h后miR 396 b的表達(dá)量下調(diào)了37%，推測火龍果miR 396 b可能參與應(yīng)答干旱脅迫。

3 討 論

自第1個(gè)miRNA(lin-4)在線蟲(Caenorhabditiselegans)中被發(fā)現(xiàn)以來，很多學(xué)者便展開miRNA作用機(jī)理的研究[16]。為探討更多miRNA的未知功能，選擇合適的方法尤為重要，雖因miRNA的短小對(duì)其研究提出了巨大挑戰(zhàn)，但仍有多種檢測方法被開發(fā)出來[8-9,17-18]。qRT-PCR 技術(shù)包括熒光染料法和探針法[19]。探針法主要采用Taq Man熒光探針，特異性高于染料法，但成本高。本研究設(shè)計(jì)特異性莖環(huán)反轉(zhuǎn)錄引物，通過熒光染料SYBR Green I qRT-PCR檢測火龍果miR 396 b的表達(dá)量相對(duì)PAP加尾法更具優(yōu)勢，本研究結(jié)果與相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道莖環(huán)法、加尾法檢測miRNA的精確度、特異性和靈敏度一致[20-23]。

樣本5SU6莖(干旱2h)20.41±0.0519.01±0.09莖(干旱8h)20.43±0.0919.37±0.05莖(干旱20h)21.42±0.1119.04±0.20肉質(zhì)莖20.31±0.0418.91±0.45果實(shí)19.85±0.3918.18±0.10根21.05±0.1419.39±0.21

本實(shí)驗(yàn)用莖環(huán)法、加尾法分別對(duì)火龍果miR 396 b進(jìn)行了處理，人為地延長了反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物，其中設(shè)計(jì)的莖環(huán)結(jié)構(gòu)hpo-miR 396 b反轉(zhuǎn)錄引物，經(jīng)qRT-PCR發(fā)現(xiàn)引物特異性、擴(kuò)增效率和R2均符合實(shí)驗(yàn)要求，表明該方法可以準(zhǔn)確的反應(yīng)hpo-miR 396 b的表達(dá)量。在內(nèi)參基因的選擇上，本實(shí)驗(yàn)探究出U 6更適合作為火龍果miRNA的內(nèi)參基因。相關(guān)獻(xiàn)報(bào)道選擇同種屬表達(dá)量恒定的miRNA作為內(nèi)參定量結(jié)果更準(zhǔn)確[24]，在實(shí)際研究中，建議選擇多個(gè)預(yù)作為miRNA內(nèi)參的基因進(jìn)行穩(wěn)定性評(píng)價(jià)后，最終選擇一個(gè)合適的內(nèi)參。

本研究發(fā)現(xiàn)，hpo-miR 396 b在火龍果的莖、根、果實(shí)中均有表達(dá)，且在果實(shí)中的表達(dá)量最高。 有報(bào)道表明，miR 396在植物不同組織均有不同程度的表達(dá)[25-27]。Kim等[28]和Liu等[29]研究發(fā)現(xiàn)擬南芥GRF家族9個(gè)成員中有6個(gè)是miR 396的靶基因。在植物中，miR 396通過介導(dǎo)GRF進(jìn)而調(diào)控細(xì)胞的增殖分化[25]；影響著植物的生長發(fā)育及逆境響應(yīng)能力[30]?；瘕埞鹔po-miR 396 b在果實(shí)中積累，可能通過介導(dǎo)靶基因GRF從而調(diào)控果實(shí)的發(fā)育，這可能是我們發(fā)現(xiàn)火龍果果實(shí)中miR 396 b表達(dá)量高的原因。此外，hpo-miR 396 b在火龍果干旱處理后表達(dá)量呈下調(diào)趨勢，暗示hpo-miR 396 b在響應(yīng)干旱脅迫中具有重要作用，這與劉偉燦[31]對(duì)干旱脅迫下大豆miR 396的研究結(jié)果一致。本研究成功建立了火龍果miRNA 莖環(huán)SYBR Green I qRT-PCR檢測體系，為火龍果相關(guān)miRNA的研究奠定了基礎(chǔ)。