不同pH值溶液對(duì)藍(lán)莓種子萌發(fā)特性的影響

秦公偉 曹小勇 尚書鳳 張曉娟

(1.陜西理工大學(xué)生物科學(xué)與工程學(xué)院, 陜西 漢中 723000; 2.陜西理工大學(xué)資源生物重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 陜西 漢中 723000)

藍(lán)莓(Blueberry)又名越橘、越桔或藍(lán)漿果，屬杜鵑花科越桔屬(Vacciniodeae)多年生落葉或常綠灌木。藍(lán)莓作為當(dāng)前全球第二大漿果，全世界約有400多種，廣泛分布于北半球，我國有91種(28個(gè)變種)，主要分布于東北、西南與華南地區(qū)，全國形成了長白山、遼東半島、膠東半島、長江流域和西南5 大藍(lán)莓主產(chǎn)區(qū)[1-3]。藍(lán)莓果實(shí)為深藍(lán)色漿果，富含有花青素苷、黃酮、葉酸、兒茶酸、類黃酮等生理活性成分，抗氧化能力居果品、 蔬菜之首, 具有提高視力、延緩衰老、增強(qiáng)心臟功能與防癌等多種功效[4-5]，集營養(yǎng)與保健于一身，具有較高經(jīng)濟(jì)價(jià)值和廣闊的開發(fā)前景，被國際糧農(nóng)組織(FAO)列為人類5大健康食品之一，被譽(yù)為“漿果之王”[6-7]。

種子繁殖是植物有性生殖的重要手段，也是聯(lián)系上下代的紐帶。盡管藍(lán)莓通常以無性繁殖為主，但新品種的選育必須依靠種子繁殖[8]，且種子繁殖苗攜帶病毒概率低，可作為優(yōu)良砧木，農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中具有很高利用價(jià)值。由于藍(lán)莓種子具有休眠特性，加之體積微小，自然條件下不易萌發(fā)[9]；劉肖等研究表明，藍(lán)莓種子萌發(fā)率低，萌發(fā)時(shí)間長，雜交種子需要55 d才能萌發(fā)，且萌芽率僅為4%[10]；較大的種子也因種皮厚而無法萌發(fā)，有的種子不能形成完整的胚，藍(lán)莓雜交后種子發(fā)芽率低[9,11]；楊春玉等研究發(fā)現(xiàn)，7個(gè)藍(lán)莓品種采收后即播發(fā)芽率為5%～19%[12]；赤霉素處理后對(duì)藍(lán)莓種子的最高發(fā)芽率也僅為25%[13]。藍(lán)莓種子發(fā)芽率低，無法進(jìn)行有效選種，成為創(chuàng)新藍(lán)莓種質(zhì)資源與選育自主知識(shí)產(chǎn)權(quán)新品種的重要瓶頸。因此探索解除藍(lán)莓種子休眠方法、尋找提高種子萌發(fā)的途徑，對(duì)藍(lán)莓實(shí)生苗的獲得、分離世代的選擇以及基因型純合品種的選育，指導(dǎo)苗木生產(chǎn)實(shí)踐均有重要意義。

種子的萌發(fā)狀況是育種的關(guān)鍵步驟，植物種子萌發(fā)過程中受多種因素的調(diào)控，其中環(huán)境pH是重要的影響因素之一。研究表明，適宜的pH有利于種子的萌發(fā)，在花生、毛白楊、銀杏等有相關(guān)的研究報(bào)道[14-16]。而種子大小作為植物生活史特征關(guān)鍵變量，同樣與種子萌發(fā)密切相關(guān)[17]，種子大小和萌發(fā)能力的研究一直倍受重視?，F(xiàn)有研究普遍認(rèn)為，藍(lán)莓屬于“好酸”植物，適宜在酸性條件下生長，藍(lán)莓大田栽培及離體組織培養(yǎng)中常常選擇pH值為5.8以下的酸性環(huán)境[18-20]。而關(guān)于藍(lán)莓種子萌發(fā)中適宜pH研究較少，不同大小級(jí)別的藍(lán)莓種子對(duì)pH的敏感性差異目前尚無研究報(bào)道。本研究以pH為自變量，以藍(lán)莓種子大小為調(diào)節(jié)變量，分析pH值與不同大小藍(lán)莓種子萌發(fā)之間的關(guān)系，探尋適合藍(lán)莓種子萌發(fā)的最佳酸堿環(huán)境條件，為藍(lán)莓優(yōu)良新品種的選育及引種栽培提供基礎(chǔ)資料和科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

試驗(yàn)所用藍(lán)莓種子采集于陜西省漢中市定軍山藍(lán)莓生產(chǎn)基地，品種為藍(lán)莓栽培品種燦爛(Brilliant)。采集所獲成熟的藍(lán)莓果實(shí)經(jīng)機(jī)械壓碎，加水發(fā)酵后再用1 000μm、800μm與680μm直徑的網(wǎng)篩過濾，分為大、中、小3級(jí)，分別標(biāo)記為B、M、S。從B、M、S 3級(jí)種子中隨機(jī)選取若干粒，以60粒為單個(gè)處理數(shù)，分裝于樣品瓶中備用。

1.2 試驗(yàn)處理

以滅過菌的去離子水為基準(zhǔn)溶液(pH值約6.0)，采用雷磁PHS-3 C酸度計(jì)，用1 M的HCl與NaOH調(diào)節(jié)pH值為3.0, 4.0, 5.0, 6.0, 7.0, 8.0共6組梯度溶液。分別用6個(gè)梯度的溶液處理藍(lán)莓B、M、S 3級(jí)種子，18種處理組合如表1所示。將B、M、S藍(lán)莓種子用不同pH溶液浸泡24 h,用滅過菌的去離子水沖洗7～8次，再用對(duì)應(yīng)pH溶液沖洗3～4次，將藍(lán)莓種子均勻地播種于90 cm帶紗布的滅過菌的培養(yǎng)皿中，每個(gè)處理60粒，重復(fù)2次。向每皿中添加等量的處理pH溶液，保證紗布充分濕潤，以傾斜時(shí)培養(yǎng)皿底部無積水為宜，用parafilm封口膜在培養(yǎng)皿上下蓋間隙纏繞一圈密封，確保皿內(nèi)濕度相對(duì)恒定。然后將各培養(yǎng)皿置于溫度為(25±1)℃的恒溫培養(yǎng)箱中進(jìn)行保濕培養(yǎng)，先黑暗培養(yǎng)1周，從第2周開始1 500 lx光照培養(yǎng)，定期觀察統(tǒng)計(jì)各項(xiàng)萌發(fā)指標(biāo)。

表1 pH值對(duì)不同大小藍(lán)莓種子萌發(fā)的處理的試驗(yàn)

處理種子大小pH處理種子大小pH處理種子大小pH1B3.07M3.013S3.02B4.08M4.014S4.03B5.09M5.015S5.04B6.010M6.016S6.05B7.011M7.017S7.06B8.012M8.018S8.0

1.3 種子發(fā)芽指標(biāo)的測定

1) 萌發(fā)率(%)=(發(fā)芽穩(wěn)定后的萌發(fā)粒數(shù)/供試種子總數(shù))×100%；

2) 發(fā)芽勢(shì)(%)=[規(guī)定天數(shù)內(nèi)(25 d)種子發(fā)芽粒數(shù)/供試種子粒數(shù)]×100%；

3) 子葉展開率(%)=(子葉展開數(shù)/供試種子總數(shù))×100%；

4) 發(fā)芽指數(shù)=∑(Gt/Dt)，式中，Gt為t天內(nèi)的發(fā)芽種子數(shù)，Dt為發(fā)芽天數(shù)；

5) 萌發(fā)時(shí)滯(d)：第1粒種子萌發(fā)所需天數(shù)；

6) 萌發(fā)歷期(d)：第1粒種子和最后1粒種子萌發(fā)時(shí)間差；

7) 胚芽長度(mm)：種子播種的第55天，從每個(gè)培養(yǎng)皿選取5粒萌發(fā)的種子，測定胚芽長度(若不足5粒則全部測量)；

8) 萌發(fā)值=(∑DGS/N)×Gr×10，式中，DGS為日累積萌發(fā)數(shù)除以相應(yīng)的萌發(fā)天數(shù)所得商，N為從萌發(fā)開始到結(jié)束的天數(shù)，Gr為最終萌發(fā)率[21-22]。

1.4 數(shù)據(jù)分析

應(yīng)用Microsoft Excel 2010軟件繪制圖表，SPSS 19.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。不同pH對(duì)藍(lán)莓種子的發(fā)芽勢(shì)、發(fā)芽率、子葉展開率、萌發(fā)指數(shù)、萌發(fā)值等的影響，采用單因素方差(One-way ANOVA)分析。若統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)方差齊性時(shí)，采用鄧肯氏新復(fù)極差法Duncan(Duncan's new multiple range test)進(jìn)行多重比較；若統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)方差不齊時(shí)，選擇Games-Howell進(jìn)行比較；其中p<0.05為差異顯著，p<0.01為差異極顯著。

表2 不同大小藍(lán)莓種子的萌發(fā)特性統(tǒng)計(jì)表

種子大小萌發(fā)時(shí)滯/d萌發(fā)歷期/d發(fā)芽勢(shì)/%萌發(fā)率/%子葉展開率/%發(fā)芽指數(shù)萌發(fā)值B14.00±1.2839.33±1.7828.61±5.9842.08±10.0438.33±15.721.17±0.24579.85±247.67M20.33±3.0234.67±3.0210.83±10.0117.12±16.1515.83±15.140.28±0.2694.34±126.85S>28—0.00±0.000.42±0.750.00±0.000.01±0.020.19±0.36

2 結(jié)果與分析

2.1 種子大小與萌發(fā)特性的關(guān)系

藍(lán)莓種子大小不同，種子的萌發(fā)特性差異較大(表2)。B種子萌發(fā)較早,平均14 d左右，M種子萌發(fā)較B種子滯后1周左右，S種子萌發(fā)最晚，28 d才開始萌發(fā)。另外，從發(fā)芽勢(shì)、萌發(fā)率、子葉展開率、發(fā)芽指數(shù)及萌發(fā)值等各項(xiàng)特性指標(biāo)上，B種子也同樣表現(xiàn)出顯著優(yōu)于M種子與S種子的萌發(fā)優(yōu)勢(shì)。不同大小藍(lán)莓種子的總體萌發(fā)趨勢(shì)為：B>M>S；可見，種子大小是影響藍(lán)莓種子萌發(fā)的重要因素。

2.2 pH對(duì)藍(lán)莓大種子(B)萌發(fā)的影響

2.2.1pH對(duì)藍(lán)莓B種子發(fā)芽勢(shì)與萌發(fā)率的影響

不同pH處理?xiàng)l件下，藍(lán)莓B種子的平均發(fā)芽勢(shì)為28.61%，平均萌發(fā)率為42.08%。當(dāng)pH為4.0時(shí)，藍(lán)莓B種子的發(fā)芽勢(shì)為39.17%，萌發(fā)率為62.50%，在這2個(gè)指標(biāo)上明顯高于其他pH值組(圖1-A、B)，且不同處理間差異極顯著(F=55.467,p<0.01；F=114.06,p<0.01)，說明pH=4.0是藍(lán)莓B種子萌發(fā)的合適條件。

2.2.2pH對(duì)藍(lán)莓B種子子葉展開率與胚芽長度的影響

不同pH處理?xiàng)l件下，藍(lán)莓B種子的平均子葉展開率為38.33%。在pH為4.0處理?xiàng)l件下，藍(lán)莓B種子的子葉展開率達(dá)到最大值(59.17%)(圖1-C)，且不同pH處理間統(tǒng)計(jì)檢驗(yàn)在99%概率水平上差異顯著(F=389.99,p<0.01)。藍(lán)莓B種子胚芽平均長度為7.2 mm，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明pH=4.0時(shí)，其胚芽長度為7.8 mm(圖1-D)，顯著高于其他pH處理組(F=192.65,p<0.01)，由此可見pH=4.0這種偏酸環(huán)境有利于藍(lán)莓B種子子葉的展開與胚芽的伸長。

2.2.3pH對(duì)藍(lán)莓B種子發(fā)芽指數(shù)與萌發(fā)值的影響

發(fā)芽指數(shù)指單位時(shí)間種子發(fā)芽的個(gè)數(shù)，代表著種子的發(fā)芽速度，是種子萌發(fā)的綜合評(píng)價(jià)指標(biāo)。藍(lán)莓B種子在不同pH環(huán)境條件下，發(fā)芽指數(shù)明顯不同(圖1-E)。當(dāng)pH為4.0時(shí)發(fā)芽指數(shù)為1.56，是中性環(huán)境(pH=7.0)發(fā)芽指數(shù)的1.41倍，且方差檢驗(yàn)結(jié)果差異極其顯著(F=109.95,p<0.01)。從“萌發(fā)值”指標(biāo)上分析，pH=4.0對(duì)藍(lán)莓B種子的萌發(fā)表現(xiàn)出非常明顯的促進(jìn)優(yōu)勢(shì)(F=94.28,p<0.01)(圖1-F)；說明pH=4.0環(huán)境條件下藍(lán)莓B種子的萌發(fā)速度相對(duì)最快。

2.2.4pH對(duì)藍(lán)莓B種子發(fā)芽時(shí)滯與萌發(fā)歷期的影響

不同pH處理?xiàng)l件下，藍(lán)莓B種子萌發(fā)時(shí)間存在差異(圖1-G、H)。當(dāng)pH為3.0～5.0時(shí)，藍(lán)莓B種子的萌發(fā)時(shí)間為12～13 d,顯著早于其他pH值，且不同處理間差異極其顯著(F=9.60,p<0.05)；當(dāng)pH=3.0與pH=4.0時(shí)，藍(lán)莓B種子所有種子萌發(fā)完成所需時(shí)間也顯著短于其他處理組(F=19.60,p<0.01)，說明較低的pH環(huán)境有利于藍(lán)莓B種子提早萌發(fā)，而且種子萌發(fā)的時(shí)間段相對(duì)集中。

2.3 pH對(duì)藍(lán)莓中種子(M)萌發(fā)的影響

2.3.1pH對(duì)藍(lán)莓M種子發(fā)芽勢(shì)與萌發(fā)率的影響

藍(lán)莓M種子的發(fā)芽勢(shì)與不同pH處理間存在明顯的依變關(guān)系(圖2-A)，pH較低(3.0)或pH較高(6.0以上)，藍(lán)莓B種子的發(fā)芽勢(shì)均表現(xiàn)在較低的水平上，如pH=3.0時(shí),發(fā)芽勢(shì)為4.17%，pH=8.0時(shí),發(fā)芽勢(shì)為6.67%；而pH在4.0或5.0時(shí)發(fā)芽勢(shì)較高，尤其是當(dāng)pH=4.0時(shí)發(fā)芽勢(shì)達(dá)到最高水平(30.00%)，且不同處理間差異極顯著(F=78.20,p<0.01)；對(duì)于萌發(fā)率指標(biāo)而言，也表現(xiàn)出與“發(fā)芽勢(shì)”指標(biāo)類似的效應(yīng)規(guī)律(圖2-B)，且差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=205.33,p<0.01)。同理說明pH=4.0對(duì)藍(lán)莓M種子萌發(fā)比較適宜。

2.3.2pH對(duì)藍(lán)莓M種子子葉展開率與胚芽長度的影響

藍(lán)莓M種子的子葉展開率，在不同pH處理?xiàng)l件下，差異非常明顯(圖2-C)。當(dāng)pH為7.0時(shí)，子葉展開率僅為3.33%，而僅當(dāng)pH在4.0～5.0時(shí)表現(xiàn)出較好的子葉展開狀態(tài)，且pH為4.0時(shí)達(dá)到最大值(44.17%)，不同處理間差異極其顯著(F=389.70，p<0.01)。藍(lán)莓M種子的胚芽長度平均為5.6 mm,pH為4.0時(shí)胚芽長度為7.3mm(圖2-D),且統(tǒng)計(jì)學(xué)上99%概率水平上優(yōu)于其他處理組(F=5.89，p<0.01)。

注：圖中不同小寫字母表示差異顯著(p<0.05)。下同。圖1 pH對(duì)藍(lán)莓B種子萌發(fā)特性的影響

2.3.3pH對(duì)藍(lán)莓M種子發(fā)芽指數(shù)與萌發(fā)值的影響

M種子的發(fā)芽指數(shù)總體上小于B種子，當(dāng)pH為7.0時(shí)M種子的發(fā)芽指數(shù)僅為0.11；但就M種子的6組不同pH處理而言，各組間發(fā)芽指數(shù)水平存在明顯差異,pH=4.0時(shí)發(fā)芽指數(shù)達(dá)到最大值(圖2-E),方差檢驗(yàn)結(jié)果差異極其顯著(F=324.378,p<0.01)。另外，在“萌發(fā)值”指標(biāo)上，M種子在各pH處理間差異極其顯著(F=416.89,p<0.01)，且當(dāng)pH=4.0時(shí)萌發(fā)值達(dá)到相對(duì)最高水平(285.57)。

2.3.4pH對(duì)藍(lán)莓M種子發(fā)芽時(shí)滯與萌發(fā)歷期的影響

藍(lán)莓M種子在不同pH處理?xiàng)l件下，萌發(fā)時(shí)滯與萌發(fā)歷期差異明顯(圖2-G、H)。當(dāng)pH為7.0時(shí)，藍(lán)莓M種子在22 d才開始萌發(fā)；但當(dāng)pH為4.0，萌發(fā)時(shí)間可比中性環(huán)境條件提早6 d左右，統(tǒng)計(jì)檢驗(yàn)差異極其顯著(F=19.60,p<0.01)。

圖2 pH對(duì)藍(lán)莓M種子萌發(fā)特性的影響

2.4 pH對(duì)藍(lán)莓小種子(S)萌發(fā)的影響

不同pH對(duì)藍(lán)莓小種子(S)萌發(fā)的影響見表3。由統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)可以看出，在試驗(yàn)設(shè)計(jì)的pH范圍內(nèi)，藍(lán)莓S 類種子除在個(gè)別處理上隨機(jī)萌發(fā)外，其它種子幾乎無萌發(fā)現(xiàn)象，表現(xiàn)出明顯的休眠狀態(tài)，可見藍(lán)莓S類種子的萌發(fā)與環(huán)境pH之間沒有直接的因果關(guān)聯(lián)，其種子萌發(fā)與否可能在更大程度上與種子胚自身生理狀態(tài)密切相關(guān)。

表3 pH值對(duì)藍(lán)莓S種子萌發(fā)影響的統(tǒng)計(jì)表

pH萌發(fā)時(shí)滯/d發(fā)芽勢(shì)/%萌發(fā)率/%子葉展開率/%發(fā)芽指數(shù)萌發(fā)值3—0.000.000.000.000.004291.18 0.830.000.02 0.405—0.000.000.000.000.006—0.000.000.000.000.007—0.000.000.000.000.008360.001.670.000.050.79

3 討論與結(jié)論

植物種子休眠是植物系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)程中，經(jīng)過長期進(jìn)化和演變而獲得的一種對(duì)不利環(huán)境及季節(jié)變化的生物學(xué)適應(yīng)特性[23]。但對(duì)栽培物種而言, 生產(chǎn)上往往需要破除休眠，促進(jìn)種子發(fā)芽迅速、整齊、成苗快, 從而獲得較高的經(jīng)濟(jì)產(chǎn)量。研究以陜南藍(lán)莓栽培品種燦爛(Brilliant)種子為試驗(yàn)材料，研究pH與不同大小藍(lán)莓種子萌發(fā)特性之間的關(guān)系，結(jié)果表明pH與不同大小藍(lán)莓種子的萌發(fā)水平密切相關(guān)。

種子大小是植物生活史中的 1個(gè)關(guān)鍵特征，作為植物生活史中重要的選擇焦點(diǎn)，與種子的散布、萌發(fā)等密切相關(guān)[24]。Bockstaller等[25]和 Kaya等[26]認(rèn)為，大種子自身營養(yǎng)物質(zhì)豐富，萌發(fā)時(shí)可提供充足養(yǎng)分，利于萌發(fā)成苗；但也有研究認(rèn)為，小種子抗逆性較強(qiáng)，具有較高的萌發(fā)率和較快的萌發(fā)速率[27]。藍(lán)莓種子的大小與萌發(fā)水平密切相關(guān)；具體表現(xiàn)在大(B)、中(M)、小(S)3類種子在萌發(fā)率、發(fā)芽勢(shì)、發(fā)芽指數(shù)等特性指標(biāo)上差異極顯著(p<0.01)，在相同的培養(yǎng)條件下種子越大，萌發(fā)優(yōu)勢(shì)相對(duì)越明顯。尤其是大種子萌發(fā)勢(shì)、萌發(fā)率與發(fā)芽指數(shù)顯著高于M、S類種子，表現(xiàn)出較強(qiáng)的競爭力和抵御風(fēng)險(xiǎn)的能力[28-29]。可能是由于B種子的種胚發(fā)育相對(duì)完善，生理成熟度較高，種胚內(nèi)萌發(fā)代謝相對(duì)比較活躍，且種子內(nèi)糖類 、脂質(zhì)和蛋白質(zhì)等物質(zhì)積累量高，能夠?yàn)榉N子萌發(fā)提供更為豐富的營養(yǎng)。

種子發(fā)芽是一個(gè)需要大量能量的過程，pH對(duì)植物的營養(yǎng)代謝有較大的影響?，F(xiàn)有研究認(rèn)為，藍(lán)莓屬于耐酸性植物，大多數(shù)藍(lán)莓離體培養(yǎng)中pH選擇5.2[20]；廉家盛研究表明，藍(lán)莓“美登”增殖培養(yǎng)的最適pH值為5.4[30]。pH對(duì)藍(lán)莓(燦爛)種子萌發(fā)的影響，因種子大小而異，尤其突出地表現(xiàn)在對(duì)B種子與M種子的萌發(fā)態(tài)勢(shì)上。不同pH環(huán)境下，藍(lán)莓種子的萌發(fā)率差別明顯。當(dāng)pH為4.0時(shí)，B種子的萌發(fā)率可達(dá)62.50%，而M種子萌發(fā)率也可達(dá)到41.67%，比中性環(huán)境條件下分別提高25%和35%，而這種提高恰恰正是最適pH所引起的處理效應(yīng)。研究基于種子萌發(fā)微環(huán)境pH的改變，篩選到最佳pH為4.0，證實(shí)了藍(lán)莓種子萌發(fā)過程亦“好酸”的特點(diǎn)。pH之所以能夠在較大程度上提高藍(lán)莓種子萌發(fā)水平，一方面可能因?yàn)樗{(lán)莓種子種皮比較堅(jiān)韌，透氣性與透水性較差，而酸性條件能夠腐蝕種皮，從而改善其對(duì)水分與空氣的通透性，一定程度上可破除種子的機(jī)械性休眠；另一方面，較低pH(4.0)能夠給藍(lán)莓種子萌發(fā)提供合適的酸堿環(huán)境，刺激與增強(qiáng)萌發(fā)代謝的酶促反應(yīng)，從而促進(jìn)種子萌發(fā)；且較低的pH有利于蔗糖水解為葡萄糖，加快種子對(duì)營養(yǎng)物質(zhì)的吸收。但研究發(fā)現(xiàn)S種子在試驗(yàn)處理的pH區(qū)段，除個(gè)別種子隨機(jī)萌發(fā)外，pH與種子萌發(fā)特性之間并無顯著效應(yīng)關(guān)聯(lián)；可能是由于S種子生理后熟未完成，種胚與外界的氣體、水分交換，內(nèi)源激素及內(nèi)源物質(zhì)的生理轉(zhuǎn)化存在障礙，代謝相關(guān)的酶比較“遲鈍”，對(duì)環(huán)境pH改變不敏感。

總之，種子的萌發(fā)特性是植物長期適應(yīng)環(huán)境的表現(xiàn)。不同梯度pH對(duì)藍(lán)莓種子進(jìn)行浸種處理對(duì)不同大小藍(lán)莓種子萌發(fā)特性產(chǎn)生的差異性影響是否與遺傳機(jī)制有關(guān)，還有待進(jìn)一步研究。