兩種核酸提取方法檢測(cè)丙肝HCV-RNA定量的比較

陳斌鴻，羅俊軒，張華

(佛山市第一人民醫(yī)院，廣東 佛山 528000)

丙型肝炎病毒(hepatitis C viral，HCV)是一種全球性傳染的病原體，人體感染后會(huì)引起丙型病毒性肝炎，主要通過(guò)性傳播、母嬰垂直傳播、血液傳播等途徑引起傳染。丙肝病毒是單股正鏈RNA病毒[1-2]，不穩(wěn)定，極易變異，醫(yī)學(xué)界目前尚未研制出有效預(yù)防丙肝的疫苗。因此，早期對(duì)丙型肝炎病毒進(jìn)行準(zhǔn)確的定量及對(duì)丙肝科學(xué)的診斷是十分關(guān)鍵的。目前，血液中HCV-RNA的實(shí)時(shí)熒光定量PCR[3-4]已成為HCV診斷，丙型肝炎患者抗病毒藥物治療療效檢測(cè)及血液篩查的重要手段，為滿足實(shí)驗(yàn)室要求，現(xiàn)需對(duì)兩種核酸提取[5-6]方法定量檢測(cè)HCV-RNA的正確度及與原有達(dá)安手工法結(jié)果的一致性進(jìn)行比較，選出符合臨床實(shí)驗(yàn)室要求的方法。

1 材料和方法

1.1 材料

收集2018年11月至2019年1月在佛山市第一人民醫(yī)院用Roche全自動(dòng)核酸分析儀檢測(cè)患者陽(yáng)性血清樣本30例， -80 ℃冰箱保存。

1.2 儀器與試劑

1.2.1儀器 兩種磁珠法使用SMART32半自動(dòng)核酸提取儀進(jìn)行丙型肝炎病毒核酸提取。提取后的核酸均使用IMPLEN分光光度計(jì)進(jìn)行純度檢測(cè)。使用ABI Prism7500實(shí)時(shí)熒光PCR進(jìn)行擴(kuò)增及分析。

1.2.2試劑 中元磁珠法所用試劑由重慶中元生物技術(shù)有限公司提供，達(dá)安磁珠法和達(dá)安手工法所用試劑由中山大學(xué)達(dá)安基因股份有限公司提供，所用試劑均在有限期內(nèi)。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1HCV-RNA提取 嚴(yán)格按照各自試劑說(shuō)明書(shū)要求進(jìn)行核酸提取。

1.3.2HCV-RNA核酸純度檢測(cè) 分別用各種方法試劑對(duì)應(yīng)的洗脫液進(jìn)行校準(zhǔn)和零點(diǎn)，檢測(cè)相應(yīng)吸光度OD260與OD280的比值并記錄數(shù)據(jù)。通過(guò)數(shù)據(jù)分析與觀察，所有提取的核酸的純度在1.8-2.2的可接受范圍內(nèi)，均可以進(jìn)行下一次擴(kuò)增分析。

1.3.3HCV-RNA核酸濃度檢測(cè) 三種方法提取的HCV-RNA均在ABI Prism7500實(shí)時(shí)熒光PCR儀進(jìn)行核酸濃度檢測(cè)。

2 結(jié)果

2.1 兩種方法正確度性能評(píng)價(jià)

選取實(shí)驗(yàn)室現(xiàn)用的通過(guò)室間質(zhì)評(píng)的達(dá)安手工法作為比較方法，中元磁珠法和達(dá)安磁珠法為實(shí)驗(yàn)方法。參考EP9-A2[7]文件提供的方法進(jìn)行正確度比對(duì)和偏倚評(píng)估。

2.1.1根據(jù)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)作圖 根據(jù)ABI Prism7500實(shí)時(shí)熒光PCR儀分析得出的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)，通過(guò)對(duì)數(shù)轉(zhuǎn)換，以比較方法達(dá)安手工法的檢測(cè)結(jié)果為X，實(shí)驗(yàn)方法中元磁珠法和達(dá)安磁珠法分別為對(duì)應(yīng)的Y，分別作出對(duì)應(yīng)的散點(diǎn)圖。分別以4倍的相對(duì)差值的均值作為可接受限作偏倚圖。

2.1.2方法間離群值檢驗(yàn) 以4倍的相對(duì)差值的均值作為可接受限，通過(guò)觀察圖3和圖4，可見(jiàn)沒(méi)有差值超出控制限，故方法間無(wú)離群值。

圖1 中元磁珠法檢測(cè)結(jié)果對(duì)達(dá)安手工法散點(diǎn)圖

圖2 達(dá)安磁珠法檢測(cè)結(jié)果對(duì)達(dá)安手工法散點(diǎn)圖

圖3 中元磁珠法與達(dá)安手工法的偏倚圖

圖4 達(dá)安磁珠法與達(dá)安手工法的偏倚圖

2.1.3合適范圍的檢驗(yàn) 參考文件EP9-A2，當(dāng)r≥0.975(或R2≥0.95)時(shí)，即代表X取值范圍合適。通過(guò)計(jì)算得出圖1中的r=0.984大于0.975，即可認(rèn)為中元磁珠法的取值范圍合適；同理通過(guò)計(jì)算得出圖2的r=0.988大于0.975，即可認(rèn)為達(dá)安磁珠法的取值范圍合適。

2.1.4線性回歸分析 中元磁珠法與達(dá)安手工法的線性回歸方程為：y=0.926x+0.150；達(dá)安磁珠法與達(dá)安手工法的線性回歸方程為：y=1.011x+0.111。

2.1.5預(yù)期偏倚的計(jì)算和比較 當(dāng)HCV-RNA在醫(yī)學(xué)決定水平為1000 IU/mL，通過(guò)對(duì)數(shù)轉(zhuǎn)換即Xc=3 IU/mL，以1/2允許總誤差的標(biāo)準(zhǔn)計(jì)算允許偏倚，其允許偏倚為0.15 IU/mL。計(jì)算得出中元磁珠法的預(yù)期偏倚Bc=a+(b-1)*Xc=0.1508，預(yù)期偏倚的95%可信區(qū)間為[-0.388,0.245]。符合預(yù)期偏倚的下限<允許偏倚<預(yù)期偏倚的上限的判斷標(biāo)準(zhǔn)，即認(rèn)為中元磁珠法正確度性能可以接受。同理通過(guò)計(jì)算，達(dá)安磁珠法的預(yù)期偏倚Bc=a+(b-1)*Xc=0.147 4，預(yù)期偏倚的95%可信區(qū)間為[-0.135,0.430]。符合預(yù)期偏倚的下限<允許偏倚<預(yù)期偏倚的上限的判斷標(biāo)準(zhǔn)，即認(rèn)為達(dá)安磁珠法正確度性能可以接受。

2.2 一致性比對(duì)

使用Kappa檢驗(yàn)進(jìn)行一致性比較。嚴(yán)格按照Kappa檢驗(yàn)的運(yùn)算步驟，經(jīng)計(jì)算結(jié)果如表1所示：

表1 相關(guān)系數(shù)與線性回歸方程

3 討論

丙型肝炎作為臨床上一種常見(jiàn)的傳染性疾病[8]且具有較多的傳播途徑，不單威脅著個(gè)人的身體健康，已經(jīng)成為嚴(yán)重的社會(huì)和公共問(wèn)題。丙型肝炎病毒是一種單股正鏈RNA，具有易變異的特征，因?yàn)镠CV-RNA的免疫原性較弱，導(dǎo)致機(jī)體相應(yīng)的免疫反應(yīng)水平較低，所以容易形成反復(fù)感染進(jìn)而加重病情。而且到目前為止尚未有丙肝疫苗可供使用，所以對(duì)于臨床醫(yī)生與患者來(lái)講，如果能夠更早、更準(zhǔn)確的檢驗(yàn)出病毒，對(duì)于患者后期的治療會(huì)有非常大的幫助。在臨床上，丙肝HCV-RNA準(zhǔn)確的定量對(duì)于丙型肝炎的診斷[9]，丙型肝炎患者抗病毒藥物治療療效檢測(cè)及血液篩查都有著十分重要的作用[10]。而核酸提取是HCV-RNA準(zhǔn)確定量的關(guān)鍵環(huán)節(jié)，核酸提取的差異可直接影響PCR擴(kuò)增效果與定量檢測(cè)結(jié)果。所以對(duì)于臨床實(shí)驗(yàn)室而言選擇一種符合要求的核酸提取方法，是對(duì)實(shí)驗(yàn)室人員，臨床醫(yī)生以及病人負(fù)責(zé)的做法，需要嚴(yán)謹(jǐn)?shù)膽B(tài)度。

本實(shí)驗(yàn)選取實(shí)驗(yàn)室現(xiàn)用的通過(guò)室間質(zhì)評(píng)即準(zhǔn)確度得到確認(rèn)的達(dá)安手工法作為比較方法，參加比較的中元磁珠法和達(dá)安磁珠法兩種方法為實(shí)驗(yàn)方法。對(duì)選出的30例陽(yáng)性患者標(biāo)本進(jìn)行檢測(cè)，比較兩種核酸提取方法檢測(cè)丙肝HCV-RNA定量的差異。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示兩種核酸提取方法檢測(cè)丙肝HCV-RNA定量結(jié)果的正確度均可接受，中元磁珠法與達(dá)安手工法的一致性不及達(dá)安磁珠法與手工法的一致性好。筆者認(rèn)為造成差異的原因可能是不同廠家引物設(shè)計(jì)可能存在差異。

本研究的中，由于價(jià)格高昂的原因，沒(méi)有使用Roche全自動(dòng)核酸分析儀這一行業(yè)“金標(biāo)準(zhǔn)”作為比較方法而是選擇了價(jià)格較低的達(dá)安手工法作為比較方法。本實(shí)驗(yàn)由于操作步驟較多，核酸提取過(guò)程所需時(shí)間長(zhǎng)，未能在兩個(gè)小時(shí)內(nèi)完成實(shí)驗(yàn)，但使用不同方法所提取核酸的純度檢測(cè)均在可接受范圍之內(nèi)，不能排除RNA輕微的降解和丟失。除此之外，從臨床實(shí)驗(yàn)室引入新方法關(guān)注的耗時(shí)和耗費(fèi)而言，實(shí)驗(yàn)室現(xiàn)使用的達(dá)安手工法操作繁瑣，操作步驟較中元磁珠法和達(dá)安磁珠法更多，需要多次離心與更換離心管，在多次的震蕩離心過(guò)程中，易造成RNA的丟失與降解。中元磁珠法雖前準(zhǔn)備步驟多，但提取反應(yīng)時(shí)間短，與達(dá)安磁珠法所需時(shí)常相當(dāng)。在耗材價(jià)格方面，磁珠法比較貴，且沒(méi)有獨(dú)立收費(fèi)標(biāo)準(zhǔn)。

綜上所述，在兩種磁珠法核酸提取方法檢測(cè)丙肝HCV-RNA定量的比較中，進(jìn)行比較的兩種方法正確度均可接受，而達(dá)安磁珠法的檢測(cè)結(jié)果具有較好的一致性。實(shí)驗(yàn)室可根據(jù)正確度，一致性，耗時(shí)與費(fèi)用選擇符合本實(shí)驗(yàn)室要求的方法。