人工誘導(dǎo)葡萄球菌產(chǎn)生耐藥性的研究

曾森 葉亞瓊 李嘉怡 陳仁貴 婁華 朱海琦 李培文 吳志勝 劉霜霜 劉俊杰

【摘要】目的 為了探究“超級(jí)”細(xì)菌存在的可能性及人工方法是否會(huì)誘導(dǎo)產(chǎn)生“超級(jí)”細(xì)菌。

方法 實(shí)驗(yàn)采用以葡萄球菌為實(shí)驗(yàn)菌，按NCCLS推薦的紙片擴(kuò)散法敏感試驗(yàn)測(cè)定12種抗菌藥物對(duì)實(shí)驗(yàn)菌株的抑菌圈直徑，并選出該菌株最敏感的藥物頭孢唑啉；經(jīng)多次實(shí)驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)用微量肉湯稀釋法測(cè)定頭孢唑啉對(duì)葡萄球菌的MIC值效果最佳，以及相對(duì)應(yīng)的菌液稀釋比例和藥液與菌液混合的最適比例和一種使用頭孢唑啉體外人工誘導(dǎo)葡萄球菌耐藥的方法。結(jié)果 在實(shí)驗(yàn)室條件下，經(jīng)過55代的傳代誘導(dǎo)，細(xì)菌對(duì)β-內(nèi)酰胺類藥物產(chǎn)生完全耐藥性；同時(shí)發(fā)現(xiàn)該耐藥菌株對(duì)所測(cè)非β-內(nèi)酰胺類抗生素（喹諾酮類、四環(huán)素類、氨基糖苷類和糖肽類）的敏感度增高，對(duì)氨基糖苷類的新霉素敏感度增加尤為明顯，以及耐藥菌株的形態(tài)學(xué)變化。結(jié)論 說明人工方法誘導(dǎo)產(chǎn)生“超級(jí)”細(xì)菌的可能性是比較小的。

【關(guān)鍵詞】“超級(jí)”細(xì)菌；葡萄球菌；藥敏實(shí)驗(yàn)；MIC

【中圖分類號(hào)】R969 【文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼】A 【文章編號(hào)】ISSN.2095-6681.2019.5..02

“超級(jí)細(xì)菌”是具有多重耐藥性細(xì)菌的總稱，包括耐青霉素的金黃色葡萄球菌（PRSP）、耐甲氧西林的金黃色葡萄球菌（MRSA）、耐萬古霉素腸球菌（VRE）等[1]。葡萄球菌（Staphylococcus）作為化膿性感染、敗血癥或膿毒性敗血癥的主要病原體，常造成奶牛乳腺炎等化膿性或毒素性疾病，造成巨大經(jīng)濟(jì)損失，嚴(yán)重影響畜牧業(yè)的發(fā)展[2]。耐藥菌是這些年來社會(huì)上的熱議話題之一，特別是MRSA、“超級(jí)”細(xì)菌報(bào)道以來，一度造成社會(huì)上的恐慌，甚至曾有報(bào)道稱：到2050年人類死于耐藥菌的病例將超過癌癥，科學(xué)家們對(duì)耐藥菌的研究日益迫切?！俺?jí)”細(xì)菌的耐藥性形成可能與用藥劑量、用藥頻度與寬度（使用藥物的頻率與種類多少）、細(xì)菌的自身變異（物理、化學(xué)、生物性變異）等有關(guān)。細(xì)菌耐藥性產(chǎn)生的原因極可能是細(xì)菌多次與藥物接觸（如抗生素濫用問題），導(dǎo)致細(xì)菌成為耐藥菌。

1 材料與方法

1.1 細(xì)菌的來源與鑒定

葡萄球菌菌株由佛山科學(xué)技術(shù)學(xué)院廣東省預(yù)防獸醫(yī)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室提供，經(jīng)平板劃線提純、觀察菌落形態(tài)特征、革蘭氏染色鏡檢、高鹽甘露醇培養(yǎng)基鑒定，特征與葡萄球菌一致。純化菌株用50%甘油存于-20°C冰箱備用。

1.2 試劑和儀器

藥敏紙片購(gòu)自杭州微生物試劑有限公司，批號(hào)分別為：頭孢唑啉（批號(hào)：S1012）、頭孢他啶（批號(hào)：S1019）、青霉素（批號(hào)：S1001）、苯唑西林（批號(hào)：S1002）、氨芐西林（批號(hào)：S1003）、萬古霉素（批號(hào)：S1054）、氧氟沙星（批號(hào)：S1049）、諾氟沙星（批號(hào)：S1047）、恩諾沙星（批號(hào)：S1081）、新霉素（批號(hào)：S1034）、四環(huán)素（批號(hào)：S1036）、多西環(huán)素（批號(hào)：S1037）；頭孢唑啉標(biāo)準(zhǔn)品購(gòu)自廣東省藥品檢驗(yàn)所，效價(jià)99.3%；培養(yǎng)基購(gòu)自廣東省環(huán)凱微生物科技有限公司。實(shí)驗(yàn)用品均在有效期內(nèi)使用。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 原代葡萄球菌12種抗生素的藥敏試驗(yàn)

按NCCLS（美國(guó)臨床和實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)協(xié)會(huì)）推薦的Kirby-Bauer瓊脂擴(kuò)散法藥敏試驗(yàn)測(cè)定12種抗生素對(duì)實(shí)驗(yàn)菌株的敏感程度[3]。挑單個(gè)菌落至液體培養(yǎng)基培養(yǎng)12 hr后，校正菌液濃度至0.5麥?zhǔn)媳葷岫?。均勻涂布于平板表面，然后將紙片貼于瓊脂平板表面，37°C培養(yǎng)18～24 hr后測(cè)抑菌圈，選出較敏感藥作為誘導(dǎo)抗生素（頭孢唑啉）。

1.3.2 原代葡萄球菌最小抑菌濃度（MIC值）的測(cè)定

用96孔微量肉湯稀釋法測(cè)定MIC[5]。挑單個(gè)菌落接于液體培養(yǎng)基，37℃培養(yǎng)18～24 hr后稀釋10倍制成菌懸液。將頭孢唑啉標(biāo)準(zhǔn)品配成濃度為512 μg/mL的頭孢唑啉藥液，然后倍比稀釋獲得多濃度梯度藥液。將稀釋的藥液與制成的接種懸液按1：9的比例分別加入10個(gè)濃度梯度藥的孔中，藥濃度逐孔遞減；第11孔加100 μL營(yíng)養(yǎng)肉湯作陰性對(duì)照，第12孔加100 μL稀釋的菌懸液作陽(yáng)性對(duì)照，37°C孵育

18～24 hr觀察結(jié)果。

1.3.3 頭孢唑啉體外誘導(dǎo)原代葡萄球菌耐藥

根據(jù)MIC的測(cè)定結(jié)果，取最小抑菌濃度下一濃度孔的菌液（實(shí)際藥物濃度為0.1 μg/mL），按菌液：頭孢唑啉藥液：普通營(yíng)養(yǎng)肉湯1：1：8比例混合接種至試管，于37°C培養(yǎng)24 hr，連續(xù)傳代，逐步提升藥液濃度，每隔10～20代測(cè)定敏感度。傳至第55代，實(shí)際誘導(dǎo)的藥物濃度為51.2 μg/mL，初步定義為耐藥菌。

1.3.4 耐藥菌耐藥性的測(cè)定

1.3.4.1 測(cè)定耐藥菌對(duì)原來12種抗生素的敏感性

方法參照1.3.1[3]。平板上挑取耐藥菌的單個(gè)菌落至液體培養(yǎng)基培養(yǎng)12 hr后，校正菌液濃度至0.5麥?zhǔn)媳葷針?biāo)準(zhǔn)。均勻涂布接種于平板表面，均勻?qū)⒑幖埰N于含菌平板表面，37°C培養(yǎng)箱培養(yǎng)18～24 hr后測(cè)量抑菌圈。

1.3.4.2 測(cè)定耐藥菌的最小抑菌濃度（MIC值）

方法參照1.3.2[5]。稀釋的10個(gè)濃度梯度藥液分別加到無菌96孔板中，然后將稀釋的藥液與制成的耐藥菌接種懸液按1：9的比例分別加入10個(gè)濃度梯度的10孔中，藥物濃度逐孔遞減，濃度最高為51.2 μg/mL；第11孔加100 μL普通營(yíng)養(yǎng)肉湯作為陰性對(duì)照，第12孔加100 μL稀釋后的耐藥菌接種懸液作為陽(yáng)性對(duì)照，37°C培養(yǎng)18～24 hr觀察結(jié)果。

2 結(jié) 果

2.1 耐藥葡萄球菌形態(tài)學(xué)變化

耐藥菌株普通營(yíng)養(yǎng)瓊脂平板菌落細(xì)小，稍白；耐藥菌株在甘露醇NaCl瓊脂平板上平板顏色淺黃，形態(tài)與原代菌一致。加頭孢唑啉藥液培養(yǎng)的菌液革蘭氏染色油鏡鏡檢形態(tài)松散，黏著度低，極少或不形成葡萄串狀。菌落革蘭氏染色油鏡鏡檢與典型葡萄球菌形態(tài)一致。

2.2 原代與耐藥葡萄球菌12種抗生素藥敏實(shí)驗(yàn)結(jié)果與相關(guān)變化

多次藥敏試驗(yàn)結(jié)果，原代葡萄球菌對(duì)12種抗生素均敏感，誘導(dǎo)的耐藥菌株對(duì)所測(cè)的β-內(nèi)酰胺類藥物的完全耐藥，同時(shí)發(fā)現(xiàn)耐藥菌對(duì)所測(cè)非β-內(nèi)酰胺類原先敏感的藥物的敏感度增加。

2.3 原代與耐藥葡萄球菌最小抑菌濃度（MIC值）測(cè)定結(jié)果及變化

測(cè)定MIC的實(shí)驗(yàn)菌株設(shè)為第一代，第二代開始用頭孢唑啉對(duì)菌株體外人工誘導(dǎo)。研究發(fā)現(xiàn)，每次提升藥物濃度，實(shí)驗(yàn)菌株逐步適應(yīng)環(huán)境，生長(zhǎng)速度由慢變快。傳至第55代，實(shí)際藥物濃度為51.2 μg/mL，獲得完全耐藥的葡萄球菌菌株。測(cè)得頭孢唑啉對(duì)耐藥菌株的MIC值

3 討 論

目前研究一般認(rèn)為“超級(jí)”細(xì)菌的耐藥性形成可能與用藥劑量、用藥頻度與寬度（使用藥物的頻率與種類的多少）、細(xì)菌的自身變異（物理、化學(xué)、生物性的變異）等有關(guān)。本實(shí)驗(yàn)，經(jīng)過55代的體外多步傳代誘導(dǎo)，成功誘導(dǎo)出耐藥葡萄球菌。在自然環(huán)境下，細(xì)菌長(zhǎng)期接觸低劑量的一種或多種抗生素的可能性是比較小的。說明葡萄球菌在自然環(huán)境下對(duì)頭孢唑啉是不太容易產(chǎn)生耐藥性的。本方法所需儀器設(shè)備少，能較好解決操作難度和成本的問題且誘導(dǎo)效率、準(zhǔn)確率和成功率比較好。本實(shí)驗(yàn)方法申請(qǐng)的發(fā)明專利申請(qǐng)已經(jīng)受理。

本實(shí)驗(yàn)誘導(dǎo)的耐藥菌株對(duì)所測(cè)β-內(nèi)酰胺類抗生素均由敏感變成完全耐藥、對(duì)所測(cè)非β-內(nèi)酰胺類抗生素敏感度增加，喹諾酮類抗生素氧氟沙星、諾氟沙星和恩諾沙星的抑菌圈分別從30、24、26 mm升至35、30、35 mm，四環(huán)素類抗生素四環(huán)素和多西環(huán)素的抑菌圈分別從26、21 mm升至35、30 mm，氨基糖苷類抗生素新霉素的抑菌圈從19 mm升至

33 mm，糖肽類抗生素萬古霉素的抑菌圈從16 mm升至

23 mm。其中新霉素的抑菌圈增加最多，敏感度升高最為明顯，其次是恩諾沙星和四環(huán)素。

根據(jù)目前的研究，耐藥性機(jī)制分為：細(xì)菌產(chǎn)生滅活酶或鈍化酶，破壞抗生素的結(jié)構(gòu)，使其失去活性；改變抗生素作用的靶位蛋白結(jié)構(gòu)和數(shù)量，使細(xì)菌對(duì)抗生素不再敏感；細(xì)菌細(xì)胞膜滲透性改變，使抗生素不能進(jìn)入菌體內(nèi)部；細(xì)菌主動(dòng)藥物外排泵作用，將抗生素排出菌體；細(xì)菌生物被膜的形成，降低抗生素作用等[1-9]。而該耐藥菌的耐藥機(jī)制及對(duì)非β-內(nèi)酰胺類抗生素敏感度增加的原因尚不清楚，有待進(jìn)一步深入研究。

通過本實(shí)驗(yàn)說明低劑量藥物多次體外誘導(dǎo)可以誘導(dǎo)葡萄球菌產(chǎn)生對(duì)β-內(nèi)酰胺類抗生素的完全耐藥；但該耐受菌株卻大大增加了對(duì)其他類抗生素的敏感性。同時(shí)在此呼吁臨床應(yīng)合理使用抗生素。

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本文編輯：趙小龍