MicroRNA-574-5p對(duì)冠狀動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞生長(zhǎng)的影響及其調(diào)控機(jī)制

楊曉偉，張拓偉，閆泱錦

(1.西北大學(xué)附屬醫(yī)院西安市第三醫(yī)院心血管內(nèi)科；2.西安市中醫(yī)醫(yī)院心血管病科，陜西 西安 710018)

冠心病(coronary artery heart disease，CAD)是由冠狀動(dòng)脈壁粥樣硬化斑塊所致，是導(dǎo)致患者死亡和殘疾的主要原因。血管平滑肌細(xì)胞(vascular smooth muscle cells，VSMCs)的異常增殖可促進(jìn)動(dòng)脈粥樣硬化斑塊的形成，而VSMCs凋亡可能與CAD相關(guān)炎癥的發(fā)生有關(guān)[1]。因此，了解動(dòng)脈粥樣硬化斑塊發(fā)育中VSMCs的行為可為預(yù)防和治療CAD提供可能的靶點(diǎn)。MicroRNAs(miRNA)是小的非編碼RNA，其在轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)節(jié)基因表達(dá)。在血管損傷的體內(nèi)和體外研究中顯示[2]，miR-23b可調(diào)節(jié)VSMCs表型轉(zhuǎn)換。CAD和其并發(fā)癥的病理生理機(jī)制可能與miR-133a釋放入冠脈循環(huán)中有關(guān)[3]。既有研究[4]表明，在CAD患者血清中miR-574-5p表達(dá)增加，但其在CAD發(fā)生中的分子功能及調(diào)節(jié)的分子機(jī)制還尚未完全清楚。本研究通過檢測(cè)CAD患者外周血中miR-574-5p mRNA表達(dá)水平，以探討miR-574-5p對(duì)VSMCs增殖及凋亡的調(diào)控作用及分子機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料

10例確診為冠心病的患者及10名體檢健康人來自西北大學(xué)附屬醫(yī)院西安市第三醫(yī)院心血管內(nèi)科，其對(duì)本研究的目的均知情同意。取外周靜脈血制備成血清，于-80 ℃儲(chǔ)存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng) 將正常人T/G HA-VSMC(購自美國ATCC公司)培養(yǎng)在含10%胎牛血清和平滑肌細(xì)胞特異性生長(zhǎng)因子的DMEM培養(yǎng)基中。在37 ℃、5%CO2的條件下培養(yǎng)。取第3～8代細(xì)胞進(jìn)行隨后的實(shí)驗(yàn)。

1.2.2 細(xì)胞轉(zhuǎn)染 嚴(yán)格按照說明書進(jìn)行瞬時(shí)轉(zhuǎn)染。采用脂質(zhì)體3000(美國Invitrogen公司)將miRNA-574-5p類似物以及它的陰性對(duì)照(購自廣州銳博生物科技有限公司)轉(zhuǎn)染入VSMCs中。轉(zhuǎn)染后48 h收集細(xì)胞，實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)轉(zhuǎn)染效率。此外，采用脂質(zhì)體2000(美國Invitrogen公司)將0.5 g pcDNA3.1/ZDHHC14或者pcDNA 3.1(由上海吉瑪制藥技術(shù)有限公司設(shè)計(jì))對(duì)照質(zhì)粒轉(zhuǎn)染入miRNA-574-5p類似物轉(zhuǎn)染的VSMCs中。于轉(zhuǎn)染后48 h收集細(xì)胞，進(jìn)行后續(xù)試驗(yàn)。

1.2.3 實(shí)時(shí)定量PCR 按照說明書，采用Trizol試劑(美國Invitrogen公司)從細(xì)胞及血清中分離總RNA。隨后用反轉(zhuǎn)錄試劑盒(美國Invitrogen公司)將RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA。LightCycler 480 SYBR Green I Master Mix(美國Invitrogen公司)檢測(cè)mRNA的表達(dá)。2-ΔΔCt方法進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。內(nèi)參為β-actin。Primer Designing Tool在線軟件設(shè)計(jì)引物。見表1。

1.2.4 細(xì)胞增殖 MTT法檢測(cè)細(xì)胞增殖。將細(xì)胞以每孔103個(gè)細(xì)胞種植于96孔板中，分別培養(yǎng)1 d、2 d、3 d、4 d、5 d和6 d后檢測(cè)細(xì)胞增殖。按照操作說明書，在每孔中加入20 LMTT溶液，離心后棄去上清，再加入150 L二甲基亞砜，搖晃10 min。用酶標(biāo)儀(美國Bio-rad公司制造)在波長(zhǎng)570 nm處讀取吸光值。

表1 引物設(shè)計(jì)

1.2.5 細(xì)胞凋亡 收集對(duì)數(shù)期細(xì)胞，制成懸浮細(xì)胞后，加入5 μL Annexin V-FITC混勻，再加入5 μL PI混勻。室溫避光反應(yīng)5～15 min，流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡比例。

1.2.6 雙熒光素酶報(bào)告分析 PCR擴(kuò)增ZDHHC14和突變序列的3′-UTR端，然后將擴(kuò)增的序列插入pGL3熒光素酶啟動(dòng)子載體(美國Promega公司)中構(gòu)建報(bào)告基因質(zhì)粒。限制性酶切位點(diǎn)為XbaⅠ和FseⅠ。采用脂質(zhì)體2000將miRNA-574-5p類似物和ZDHHC14 3′-UTR或者突變的3′-UTR共轉(zhuǎn)染入VSMCs中，48 h后，采用Dual-GloLuciferase Assay(美國Promega公司)檢測(cè)熒光素酶活性。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 miRNA-574-5p在冠狀動(dòng)脈疾病患者血清中的表達(dá)

與正常體檢者對(duì)比，CAD患者血清中miRNA-574-5p的表達(dá)顯著增加，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見圖1。

2.2 miRNA-574-5p調(diào)節(jié)VSMCs的增殖和凋亡

與陰性對(duì)照組相比，miRNA-574-5p類似物轉(zhuǎn)染后，miRNA-574-5p的表達(dá)顯著提高(P<0.01)。且miRNA-574-5p顯著提高VSMCs的增殖(P<0.01)，降低VSMCs的凋亡(P<0.01)。見圖2。

2.3 miRNA-574-5p的靶基因?yàn)閆DHHC14

采用在線miRNA 靶基因預(yù)測(cè)軟件TargetScan和MicroRNA Targets and Expression預(yù)測(cè)ZDHHC14為miRNA-574-5p的靶基因。雙熒光素酶報(bào)告分析結(jié)果顯示，miRNA-574-5p顯著降低ZDHHC14 3’-UTR端的熒光素酶活性(P<0.01)。且miRNA-574-5p抑制ZDHHC14的表達(dá)(P<0.01)。見圖3。

2.4 ZDHHC14影響VSMCs的增殖和凋亡

ZDHHC14過表達(dá)降低miRNA-574-5p誘導(dǎo)的VSMCs的增殖(P<0.05)，提高miRNA-574-5p誘導(dǎo)的VSMCs的凋亡(P<0.05)。見圖4。

3 討論

miRNAs可結(jié)合其靶基因的3′-UTRs，在轉(zhuǎn)錄和翻譯水平調(diào)節(jié)基因的表達(dá)。研究[5-6]表明，miRNAs在自體免疫疾病、發(fā)育異常以及心血管疾病等諸多生理病理過程中發(fā)揮重要作用。近幾年的研究也表明[7-8]，CAD中檢測(cè)出多種miRNAs表達(dá)異常。因此，調(diào)節(jié)miRNAs的表達(dá)可能是改善某些疾病發(fā)展過程的有效措施，如其可降低血管損傷誘導(dǎo)的VSMCs增殖、內(nèi)皮細(xì)胞再生，以及降低病理性心肌肥大[9]。miRNA-574位于人染色體的內(nèi)含子區(qū)域。最初認(rèn)為[10]，miR-574-5p由人染色體4上編碼的Noxp20基因的第一個(gè)內(nèi)含子調(diào)控的，但近期的研究發(fā)現(xiàn)[11-13]，miR-574-5p參與心血管疾病，肺癌和結(jié)腸癌等各種疾病。表明miR-574-5p參與眾多疾病的發(fā)展過程，涉及其調(diào)控的信號(hào)途徑也比較復(fù)雜。miR-574-5p可通過增加TLR9信號(hào)促進(jìn)肺癌的發(fā)展[12]。在結(jié)腸癌組織中檢測(cè)出上調(diào)的miR-574-5p，且其促進(jìn)結(jié)腸癌細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲[13]。此外，對(duì)心肌梗塞患者缺血部位的等級(jí)聚類分析顯示，miR-574-3p和miR-574-5p表達(dá)顯著增加[11]。

雖然miR-574-5p調(diào)控多種疾病，但是其在CAD中潛在的功能和分子機(jī)制仍沒有完全闡明。本研究顯示，與健康體檢者相比，miR-574-5p在CAD患者的血清中顯著上調(diào)。符合之前的研究結(jié)果，在CAD患者中，miR-574-5p表達(dá)增加[4]。此外，本研究也顯示，miR-574-5p可促進(jìn)VSMCs增殖，抑制其凋亡。表明miR-574-5p是CAD相關(guān)因子，可能是CAD潛在的診斷性生物標(biāo)志物以及治療的一個(gè)選擇。進(jìn)一步的研究表明，腫瘤抑制基因ZDHHC14為miR-574-5p的靶基因[14]。本研究也表明，miR-574-5p可以結(jié)合在ZDHHC14 3′-UTR端，抑制其mRNA的表達(dá)。

ZDHHC14是DHHC棕櫚酰轉(zhuǎn)移酶家族的成員。人DHHC涉及神經(jīng)障礙和癌癥等多種疾病，DHHC2與興奮性突觸的結(jié)構(gòu)和功能可塑性相關(guān)[15]，與肝癌細(xì)胞的發(fā)展和轉(zhuǎn)移有關(guān)[16]。ZDHHC14也在胃癌、彌漫性大B細(xì)胞淋巴瘤以及急性白血病等多種疾病中表達(dá)異常[17]。本研究表明，ZDHHC14過表達(dá)降低VSMCs增殖，促進(jìn)VSMCs凋亡。因此，miR-574-5p通過靶向ZDHHC14基因參與CAD的調(diào)控，表明它可能成為CAD治療的一個(gè)靶點(diǎn)。

miR-574-5p也有其他的靶基因。miR-574-5p靶向BACE1調(diào)節(jié)認(rèn)知缺陷中的心血管疾病[18]。miR-574-5p直接靶定檢查點(diǎn)抑制因子1促進(jìn)肺癌細(xì)胞增殖[13]。miR-574-5p靶向癌癥細(xì)胞侵襲抑制因子調(diào)控乳頭狀甲狀腺癌細(xì)胞增殖[19]。本研究還沒有涉及miR-574-5p是否靶向調(diào)節(jié)細(xì)胞生長(zhǎng)和凋亡的其他基因。因此，進(jìn)一步的研究應(yīng)該重點(diǎn)弄清miR-574-5p靶向其他基因在VSMCs調(diào)控中的作用。

總之，miR-574-5p在CAD患者的血清中表達(dá)增加，其過表達(dá)可通過靶向并下調(diào)ZDHHC14，促進(jìn)VSMCs增殖及抑制其凋亡。miR-574-5p可能為CAD相關(guān)因子，并可能成為CAD治療的潛在分子靶點(diǎn)。