抗炎及抗自由基治療對腦缺血/再灌注后成年大鼠神經(jīng)干細(xì)胞增殖及BDNF和VEGF表達(dá)的影響

張小東，王藝蓉，賀詩佳，謝鵬

(1.川北醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科，四川 南充 637000；2.重慶醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科，重慶 400016)

缺血性卒中是一種高發(fā)病率、高致殘率和高死亡率的常見病和多發(fā)病。目前神經(jīng)保護(hù)治療是近年尚在試驗(yàn)的一種重要治療措施[1]。目前，國內(nèi)外有關(guān)抗炎和抗自由基治療對內(nèi)源性神經(jīng)干細(xì)胞增殖和神經(jīng)生長因子的影響情況報(bào)道較少[2]。本研究通過建立大鼠大腦中動(dòng)脈缺血/再灌注模型(middle cerebral artery occlusion，MCAO)，觀察環(huán)磷酰胺(Cyc)、秋水仙堿(Col)和維生素C(VitC)對神經(jīng)干細(xì)胞增殖和腦源性神經(jīng)生長因子(brain derived neurotrophic growth factor，BDNF)、血管內(nèi)皮生長因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)表達(dá)的影響。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

健康成年雄性SD大鼠140只，由重慶醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)室提供，體質(zhì)量180～200 g。給予大鼠12 h的光照/黑暗循環(huán)，并可以自由獲取食物和水。

1.2 主要試劑

Brdu購自Sigma公司，小鼠抗大鼠Brdu單克隆抗體、兔抗大鼠Nestin多克隆抗體、兔抗大鼠BDNF多克隆抗體、SABC免疫組化試劑盒(SA1021和SA1022)、原位雜交試劑盒及DAB顯色劑購自武漢博士德生物技術(shù)有限公司。

1.3 MCAO模型的建立

采用線栓法制備右側(cè)大腦中動(dòng)脈局灶腦缺血模型[3]，缺血2 h誘導(dǎo)缺血再灌注。假手術(shù)組進(jìn)行類似的手術(shù)，但植入線栓后立即摘除燈絲(無阻塞，無再灌注)。行為學(xué)評分參照文獻(xiàn)5分制標(biāo)準(zhǔn)，評分≥2分者為造模成功[4]。

1.4 動(dòng)物分組

140只模型大鼠隨機(jī)分為5組：單純局灶缺血/再灌注組(I/R 組)、局灶缺血/再灌注+Cyc和Col(CC 組)、局灶缺血/再灌注+Col(Col 組)、局灶缺血/再灌注+VitC組(VitC 組)和假手術(shù)組(SC組)，每組28只。各種藥物的給藥途徑分別為：Cyc：5 mg·100 g-1·d-1，用1 mL生理鹽水溶解后腹腔注射；Col：10 μg·100 g-1·d-1，用1 mL生理鹽水溶解后灌胃；VitC：5 mg·100 g-1·d-1，用1 mL生理鹽水稀釋后腹腔注射；SC組：用1 mL生理鹽水腹腔注射。各組均每天給藥1次，連續(xù)10 d。各組分別在給藥后1、3、7、10、14、21和28 d時(shí)處死大鼠4只。處死大鼠前1 d ，每只大鼠腹腔注射Brdu，50 mg/kg，用生理鹽水1 mL稀釋后注射，1次/8 h，共3次。

1.5 取材

實(shí)驗(yàn)動(dòng)物達(dá)到觀察時(shí)相點(diǎn)時(shí)，用3.5%水合氯醛麻醉，4%多聚甲醛緩沖液(含1‰ DEPC)心臟灌注，斷頭取腦，放入4%多聚甲醛緩沖固定液(含1‰DEPC)中固定30～40 min。然后梯度酒精脫、浸蠟，石蠟包埋，切片(厚度6 μm)。取材部位：室管膜下區(qū)(Subventricular zone，SVZ)(A-P坐標(biāo)，bregma -0.30～-1.2 mm)、海馬齒狀回(subdentate gyrus zone，SGZ)(A-P坐標(biāo)，bregma -4.5～-3.14 mm)及缺血周邊區(qū)。

1.6 Brdu、Nestin、VEGF和BDNF陽性細(xì)胞的檢測

石蠟切片常規(guī)脫蠟至水，室溫下加入復(fù)合消化酶孵育10 min；蒸餾水沖洗3次，5 min/次，加入50%甲酰胺/2×SSC，65 ℃孵育2 h；2×SSC沖洗3次，5 min/次，加入2 N/L，37 ℃孵育30 min；0.01 MPBS沖洗3次，5 min/次，0.1 M硼酸(pH=8.5)室溫下孵育10 min；0.01 MPBS沖洗3次，5 min/次，加入1%過氧化氫，室溫下孵育15 min；0.01 MPBS沖洗3次，5 min/次，加入封閉液，室溫下孵育2 h；加入小鼠抗大鼠Brdu(1∶100稀釋)，4 ℃過夜， 37 ℃復(fù)溫40 min；0.01 MPBS沖洗3次，5 min/次；再加入生物素化山羊抗小鼠IgG，25 ℃孵育2 h；0.01 MPBS沖洗3次，5 min/次，SABC室溫下孵育2 h；0.01 MPBS沖洗×3次，5 min/次，DAB顯色7 min，顯微鏡下觀察終止顯色；蘇木素輕度復(fù)染。二甲苯透明，封片。Nestin和BDNF陽性細(xì)胞檢測參照免疫組化SABC法的操作步驟，原位雜交檢測VEGFmRNA，按原位雜交檢測試劑盒操作步驟進(jìn)行，DAB顯色，蘇木素復(fù)染。VEGF的mRNA探針序列為：(1)5’-GCTCTACCTCCACCATG CCAAGTG GTCC CA-3’；(2)5’-GACCCTGGTGGACATCTTCCAGGAG TACCC-3’；(3)5’-GCAGC TTGAG TTAAACGAACGTACTTGCAG-3’。

Brdu和Nestin陽性細(xì)胞計(jì)數(shù)部位為SVZ和SGZ。BDNF和VEGF陽性細(xì)胞計(jì)數(shù)部位為海馬和缺血周邊區(qū)。每只動(dòng)物每個(gè)指標(biāo)的每個(gè)部位各選取切片1張，選擇5個(gè)視野(10×40倍)，Olympus BX14型生物醫(yī)學(xué)圖像分析系統(tǒng)進(jìn)行分析，以細(xì)胞內(nèi)出現(xiàn)棕黃色顆粒者為陽性。計(jì)數(shù)每個(gè)視野的陽性細(xì)胞后，計(jì)算每只鼠所要分析部位的平均陽性細(xì)胞數(shù)，再在同一組之間取平均值。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠Brdu和Nestin的表達(dá)

I/R后SVZ和SGZ較SC組Brdu和Nestin陽性細(xì)胞計(jì)數(shù)均明顯增多，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。Brdu的表達(dá)高峰期在7 d與28 d降至正常。Nestin的表達(dá)高峰期在10 d。CC組與I/R組比較，Brdu和Nestin陽性細(xì)胞數(shù)的減少具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；Col和VitC組兩個(gè)部位各自陽性細(xì)胞計(jì)數(shù)的組間統(tǒng)計(jì)結(jié)果，與SC組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，而與單純I/R組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見表1，圖1和圖2。

表1I/R后不同時(shí)間點(diǎn)SVZ和SGZ處Brdu陽性細(xì)胞數(shù)

2.2 各組大鼠BDNF的表達(dá)

I/R后海馬和缺血周邊區(qū)的BDNF表達(dá)增強(qiáng)，表達(dá)高峰期均在7 d，與SC組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。CC組與I/R組比較，陽性細(xì)胞數(shù)明顯減少，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；Col或VitC組較SC組表達(dá)增加，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；而與I/R組比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見圖3及圖4。

2.3 VEGF的表達(dá)

I/R后海馬區(qū)和缺血周邊區(qū)的VEGF的mRNA表達(dá)增強(qiáng)，海馬的表達(dá)高峰期在7 d，而缺血周邊區(qū)的表達(dá)高峰期在1 d，與SC組相比，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。CC組與I/R組比較，陽性細(xì)胞數(shù)明顯減少，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；Col或VitC組較SC組表達(dá)增加，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；而與I/R組比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見圖5-圖7。

3 討論

腦缺血使缺血中心區(qū)細(xì)胞壞死，產(chǎn)生神經(jīng)功能缺損；同時(shí)也啟動(dòng)了機(jī)體的自身保護(hù)和修復(fù)機(jī)制，如缺血后，對神經(jīng)細(xì)胞有保護(hù)作用的BDNF[5]分泌增加，誘導(dǎo)神經(jīng)干細(xì)胞的增殖[6]。同時(shí)腦缺血也激發(fā)PER血管的再生，如缺血后VEGF表達(dá)明顯增多[7]。VEGF具有神經(jīng)保護(hù)和神經(jīng)營養(yǎng)作用，特異性地促進(jìn)血管內(nèi)皮細(xì)胞有絲分裂、調(diào)節(jié)血管生成，并可獨(dú)自誘導(dǎo)新生血管形成[8]。腦缺血后的這些反應(yīng)是恢復(fù)期腦功能代償最重要的物質(zhì)結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)。

本實(shí)驗(yàn)選用了抗炎治療藥物Cyc和Col以及抗自由基治療藥物VitC，發(fā)現(xiàn)Cyc和Col聯(lián)合作用對缺血再灌注大鼠神經(jīng)干細(xì)胞的增殖和血管及神經(jīng)生長因子的產(chǎn)生有抑制作用，而單獨(dú)應(yīng)用Col對缺血再灌注大鼠神經(jīng)干細(xì)胞的增殖和血管及神經(jīng)生長因子的產(chǎn)生既無明顯促進(jìn)作用也無明顯抑制作用。既往研究發(fā)現(xiàn)VitC對發(fā)育中的腦組織[9]和體外培養(yǎng)的神經(jīng)細(xì)胞的生長有促進(jìn)作用[10]，能夠減少自由基，具有抗氧化損傷的作用，但本研究卻發(fā)現(xiàn)VitC對上述有益指標(biāo)也無促進(jìn)作用，與既往研究結(jié)果不一致?？赡艿脑蚺c抗自由基藥物的選擇單一有關(guān)，后續(xù)的研究應(yīng)聯(lián)合超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)、別嘌醇等多種抗自由基藥物進(jìn)行對比研究。

近年來對缺血性腦血管疾病的治療做了大量深入的研究，但這些研究大都是干預(yù)缺血后的病理生理過程[11-12]。缺血會(huì)引起腦水腫、鈣超載、局部的炎性反應(yīng)、神經(jīng)細(xì)胞凋亡增加、興奮性氨基酸和自由基增多等[13]。針對這個(gè)病理生理過程提出了抗腦水腫的治療和鈣拮抗劑治療、拮抗興奮性氨基酸介導(dǎo)的毒性作用、抗炎治療等神經(jīng)保護(hù)治療措施[14]。但按照該理論所形成的治療體系，目前卻未能夠較大地推動(dòng)缺血性腦血管疾病的治療進(jìn)展，缺血性腦血管疾病臨床療效仍較差[15]。既往動(dòng)物實(shí)驗(yàn)證明有效的急性卒中神經(jīng)保護(hù)劑應(yīng)用于臨床未能發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用[16-17]：部分原因可能是其僅僅延緩了缺血區(qū)神經(jīng)細(xì)胞的死亡，卻不能最終阻止神經(jīng)元的死亡，也有可能是挽救成功的瀕死神經(jīng)細(xì)胞，不一定能夠發(fā)揮正常功能[18]；本研究發(fā)現(xiàn)聯(lián)合應(yīng)用Cyc和Col等抗炎治療藥物對干細(xì)胞和血管的增殖不利，故推測另外一個(gè)可能的原因是神經(jīng)保護(hù)劑未能促進(jìn)急性期所啟動(dòng)的神經(jīng)保護(hù)和修復(fù)機(jī)制，導(dǎo)致遠(yuǎn)期療效差。

既往報(bào)道Cyc和Col治療急性腦梗塞可以減輕腦水腫，顯著地改善患者的神經(jīng)功能缺損和預(yù)后，同時(shí)對缺血神經(jīng)細(xì)胞有保護(hù)作用[19]；但有觀點(diǎn)指出治療腦梗塞的藥物早期能夠改善腦功能，部分原因可能是由于減輕了腦水腫，減輕了對周圍組織的壓迫作用，減小了梗死體積，而不是由于神經(jīng)細(xì)胞增殖代償，因?yàn)樯窠?jīng)細(xì)胞增殖、遷移并發(fā)揮功能，且進(jìn)一步與全腦進(jìn)行功能整合至少應(yīng)該在恢復(fù)期。同時(shí)本試驗(yàn)也提示，干預(yù)缺血后的病理生理過程(如抗炎治療)雖然可能減弱某些損害，但同時(shí)可能也減弱了腦的自身保護(hù)和修復(fù)機(jī)制，因?yàn)樵撃X缺血過程同時(shí)也啟動(dòng)了腦的自身保護(hù)和修復(fù)機(jī)制。比如腦水腫減輕可能影響細(xì)胞因子的釋放，從而阻止細(xì)胞因子參與神經(jīng)細(xì)胞的增殖和血管的再生信號傳遞過程[20]，如腦梗死后TNF-α釋放增加，它會(huì)加重腦水腫，但是它卻明顯地促進(jìn)了SVZ處神經(jīng)干細(xì)胞增殖[21]。因此有必要在減少腦缺血反應(yīng)和促進(jìn)神經(jīng)修復(fù)之間尋找一個(gè)平衡點(diǎn)。