Box-Behnken效應(yīng)面法優(yōu)化牛大力總黃酮提取工藝

譚志燦 丘思蘭2,3* 高 妮

1.廣州市醫(yī)藥職業(yè)學(xué)校，廣東 廣州 510430；2.廣州醫(yī)科大學(xué)附屬第五醫(yī)院，廣東 廣州 510700；3.廣州醫(yī)科大學(xué)第五臨床學(xué)院，廣東 廣州 510700

牛大力，別名大力牛、甜牛大力、大力薯、扒山虎、血藤、金鐘根、倒吊金錘等，原植物為攀緣灌木，為豆科植物美麗崖豆藤M(fèi)illettiaspeciosaChamp.的干燥根[1]。全年均可采挖，以夏、秋季為佳，整理洗凈，除去蘆頭和須根，切厚片或切段，曬干即可。主產(chǎn)于廣東、廣西、海南、福建、湖南、云南、貴州等地,生于灌木林叢、路邊或疏林中。牛大力味甘、性平，歸肺、脾、腎經(jīng)，能補(bǔ)虛潤肺、強(qiáng)筋活絡(luò)，用于病后虛弱、陰虛咳嗽等癥?，F(xiàn)代研究表明，牛大力主要含有生物堿類化合物、黃酮類化合物、三萜類化合物、多糖類化合物和植物甾醇等多種成分[2-4]，具有鎮(zhèn)咳、祛痰、平喘、保肝、抗氧化、抗炎、抗腫瘤、提高免疫功能等作用[5-8]。本實(shí)驗(yàn)的研究對象為具有抗氧化活性的總黃酮[7]，采用Box-Behnken效應(yīng)面法優(yōu)選牛大力總黃酮提取工藝，為牛大力的綜合利用提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 儀器與材料

1.1 儀器 SP-756PC型紫外-可見分光光度計(jì)(上海光譜儀器)；CJ-100ST功率可調(diào)加溫定時(shí)型超聲波清洗機(jī)(深圳市超潔科技)；AL104型電子分析天平(上海梅特勒托利多儀器)。

1.2 材料 牛大力(批號1803001，廣州市嶺南中藥飲片有限公司)經(jīng)鑒定為豆科植物美麗崖豆藤M(fèi)illettiaspeciosaChamp.的干燥根；蘆丁對照品(批號100086-201755，中國食品藥品檢定研究院)。

2 方法與結(jié)果

2.1 含量測定[9-10]

2.1.1 對照品溶液 取蘆丁對照品適量，精密稱定，置25 mL量瓶中，加乙醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，制得每1 mL含蘆丁0.468 mg的對照品溶液。

2.1.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線 精密量取“2.1.1”項(xiàng)下對照品溶液0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0 mL，分別置25 mL量瓶中，加乙醇至6 mL，依次加入5%亞硝酸鈉溶液1 mL、10%硝酸鋁溶液1 mL，每次加入后均搖勻并放置6 min，再加入4%氫氧化鈉溶液10 mL，加水至刻度，搖勻后放置15 min，以隨行試劑為空白，于505 nm處測定吸光度，得方程A=15.1364C-0.0163，r=0.9993，線性范圍0.009 36～0.056 16 mg/mL，式中A為吸光度、C為濃度。

2.1.3 供試品溶液 取牛大力藥材粉末約1 g，精密稱定，按照“2.2”項(xiàng)下的實(shí)驗(yàn)方法制備供試品溶液。

2.1.4 樣品測定 精密量取“2.1.3”項(xiàng)下供試品溶液5 mL，照“2.1.2”項(xiàng)下的方法，測定吸光度，計(jì)算總黃酮含量。

2.2 Box-Behnken效應(yīng)面法實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)[11]根據(jù)前期的單因素試驗(yàn)結(jié)果，采用超聲提取法，功率500 W，溫度60 ℃，提取2次，選取乙醇濃度A、乙醇體積B、提取時(shí)間C為考察因素，以牛大力總黃酮的提取率為響應(yīng)值，Box-Behnken效應(yīng)面法的實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果見表1。

表1 Box-Behnken實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果

采用Design Expert 7.0.0軟件對表1實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行多元線性回歸擬合，得二次多項(xiàng)回歸模型方程：Y=-16.052 19+0.198 12A+0.554 58B+0.197 63C+1.500 00×10-3AB-1.500 00×10-4AC+8.333 33×10-5BC-1.387 50×10-3A2-0.015 139B2-1.612 50×10-3C2。結(jié)果顯示，相關(guān)系數(shù)R2為0.987 6，變異系數(shù)C.V.為1.29%，模型擬合良好。由表2可知，3個(gè)考察因素A、B、C的一次項(xiàng)和二次項(xiàng)均達(dá)極顯著水平(P<0.01)，失擬項(xiàng)不顯著(P>0.05)。為了直觀反映分析結(jié)果，采用Design Expert軟件作出相應(yīng)的等高線圖和效應(yīng)面圖，如圖1、2所示。

表2 方程的顯著性檢驗(yàn)及方差分析

注：*P<0.05顯著性差異；**P<0.01極顯著性差異。

2.3 驗(yàn)證試驗(yàn) 根據(jù)“2.2”項(xiàng)下的回歸方程確定最優(yōu)工藝：乙醇濃度81.07%，乙醇體積21.63倍，超聲提取2次、每次52.51 min，溫度60 ℃。在此條件下，牛大力總黃酮理論提取率為3.821 1 mg/g。對最佳提取工藝進(jìn)行3次驗(yàn)證試驗(yàn)，結(jié)果總黃酮平均提取率3.81 mg/g (RSD=0.961%)。驗(yàn)證試驗(yàn)表明，所優(yōu)選的提取工藝穩(wěn)定可行、重復(fù)性良好。

3 討論

實(shí)驗(yàn)采用Box-Behnken效應(yīng)面法進(jìn)行實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)，優(yōu)選牛大力總黃酮的提取工藝。Box-Behnken效應(yīng)面法具有實(shí)驗(yàn)次數(shù)少，結(jié)果預(yù)測精度高的特點(diǎn)，很好地解決了多變量問題。在實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)中，Center Points per Block設(shè)定為5，即中心點(diǎn)選擇5次重復(fù)，用以估計(jì)實(shí)驗(yàn)誤差。

根據(jù)前期的單因素試驗(yàn)結(jié)果，本次實(shí)驗(yàn)選擇超聲提取法，固定超聲功率為500 W、超聲溫度為60 ℃、提取次數(shù)為2次，選取對實(shí)驗(yàn)結(jié)果影響較大的3個(gè)因素(乙醇濃度、乙醇體積和提取時(shí)間)進(jìn)行考察，以減少Box-Behnken效應(yīng)面法的試驗(yàn)次數(shù)。由結(jié)果可知，每個(gè)因素的交互作用較小，其1次項(xiàng)和2次項(xiàng)對牛大力總黃酮提取率貢獻(xiàn)較大?；貧w模型通過顯著性檢驗(yàn)及方差分析，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)，回歸模型可信度好。利用回歸模型算出最佳工藝參數(shù)，通過驗(yàn)證試驗(yàn)，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差RSD值為0.961%，理論值和實(shí)驗(yàn)值之間高度吻合，為牛大力的綜合利用提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。