甘草-馬齒莧配伍對(duì)特應(yīng)性皮炎的免疫調(diào)節(jié)作用及其機(jī)制研究

楊富金 李 敏 高燕妮 江 雪 劉 毅

重慶市中醫(yī)院皮膚科，重慶 400011

特應(yīng)性皮炎(Atopic Dermatitis,AD)是一種慢性、復(fù)發(fā)性、炎癥性皮膚病，患者往往有劇烈瘙癢表現(xiàn)，嚴(yán)重影響其生活質(zhì)量[1]。其發(fā)病機(jī)制十分復(fù)雜，涉及遺傳因素，皮膚屏障的缺陷，免疫功能失調(diào)[2]。濕敷是中醫(yī)臨床上常用的一種外治法，濕敷是可以增加皮膚的水合作用，從而促進(jìn)藥物的吸收作用；可使局部毛細(xì)血管收縮，皮損局部充血減輕；還可吸收滲出液，保護(hù)和清潔患面，從而減輕炎癥，是一種安全有效的治療手段。甘草GlycyrrhizaeRadix(GR)，甘、平，歸心、肺、脾、胃經(jīng)，具有補(bǔ)脾益氣、清熱解毒、祛痰止咳、緩急止痛、調(diào)和諸藥的功效。甘草提取物及其黃酮類化合物、甘草酸等對(duì)皮膚炎癥、變態(tài)反應(yīng)性皮膚病、皮膚腫瘤、病毒性皮膚病、色素沉著等皮膚病均有藥理活性[3]。馬齒莧PortulacaeHerba(PH)，酸、寒，歸肝、大腸經(jīng)，具有清熱解毒、涼血止血、止痢之功效，其水提液濕敷具有清熱解毒、散血消腫之功，可治療多發(fā)性癤腫、膿包瘡、急性濕疹、過(guò)敏性皮炎、接觸性皮炎等皮膚病[4-6]。二者配伍取“酸甘化陰”之意，功在滋陰養(yǎng)胃，兩者一斂一滋，起協(xié)同作用，用治陰虛不足證。

我科在長(zhǎng)期臨床外治治療中，總結(jié)經(jīng)驗(yàn)將二者合用濕敷治療特應(yīng)性皮炎取得了較好的療效，但是缺乏系統(tǒng)科學(xué)的基礎(chǔ)研究。本實(shí)驗(yàn)以甘草和馬齒莧為研究對(duì)象，探索甘草和馬齒莧單獨(dú)用藥和配伍用藥后對(duì)AD小鼠模型免疫調(diào)節(jié)的作用，考察單獨(dú)用藥、減半配伍、不減半配伍之間的量效關(guān)系，為臨床應(yīng)用和進(jìn)一步的制劑開發(fā)提供必要的藥效學(xué)數(shù)據(jù)支撐。

1 儀器與材料

1.1 儀器 液相色譜儀(美國(guó)Agilent 1260)，PCR擴(kuò)增儀(美國(guó)Bio-RAD MJ mini)，實(shí)時(shí)熒光定量PCR(瑞士Roche Light Cycler 480)，酶標(biāo)儀(Bio-Rad iMark)，熒光倒置顯微鏡(德國(guó)萊卡DMIL-FL-EL6000)。

1.2 藥物與試劑 甘草(批號(hào)：170801)、馬齒莧(批號(hào)：170901)購(gòu)于重慶慧遠(yuǎn)藥業(yè)有限公司，經(jīng)鑒定分別為豆科植物甘草GlycyrrhizauralensisFisch的干燥根和根莖，馬齒莧科植物馬齒莧PortulacaoleraceaL的干燥地上部分。甘草苷對(duì)照品(批號(hào)：111610-201607，中國(guó)食品藥品檢定研究院)；甘草酸銨對(duì)照品(批號(hào):110731-201720,中國(guó)食品藥品檢定研究院);1-氯-2,4-二硝基苯(DNCB)為西格瑪奧德里奇(上海)貿(mào)易有限公司；cDNA合成試劑盒Transcriptor First Strand cDNA Synthesis Kit(瑞士Roche公司)；熒光定量PCR試劑盒LightCycler 480 SYBR GreenⅠMaster(瑞士Roche公司)。

1.3 動(dòng)物 6～8周齡SPF級(jí)BALB/c小鼠購(gòu)于北京華阜康生物科技股份有限公司，動(dòng)物許可證號(hào)SCXK(京)2014-0004。

2 方法

2.1 甘草馬齒莧提取物的制備 分別稱取各組相應(yīng)質(zhì)量的藥材，甘草組100 g，馬齒莧組100 g，甘草馬齒莧配伍低劑量組甘草50 g加馬齒莧50 g，甘草馬齒莧配伍高劑量組甘草100 g加馬齒莧100 g。浸泡半小時(shí)，加20倍量水，煎煮2次，每次30 min，合并藥液，濃縮至相應(yīng)濃度，甘草組藥液濃度為0.2 g/mL，馬齒莧組藥液濃度為0.2 g/mL，配伍低劑量組藥液濃度為0.2 g/mL，配伍高劑量組藥液濃度為0.4 g/mL,應(yīng)用高效液相法檢測(cè)。甘草組中甘草苷和甘草酸的含量分別為0.329 mg/mL、1.353 mg/mL，配伍低劑量組為0.221 mg/mL、0.729 mg/mL，配伍高劑量組為0.371 mg/mL、1.432 mg/mL。甘草組浸膏得率為34.6%，馬齒莧組為26.71%，配伍低劑量組為35.36%，配伍高劑量組為33.34%。

2.2 DNCB誘導(dǎo)小鼠AD模型的建立、分組及給藥 健康六周齡雌性BALB/c小鼠60只隨機(jī)分為6組，正常對(duì)照組、DNCB模型組、甘草組、馬齒莧組、配伍低劑量組、配伍高劑量組，每組10只。動(dòng)物AD模型構(gòu)建[7]及中藥干預(yù)流程如圖1，小鼠于實(shí)驗(yàn)0天脫毛處理，實(shí)驗(yàn)第一周和第二周給予每周兩次的1%DNCB(100 μL)刺激，實(shí)驗(yàn)第三周和第四周給予每周兩次的0.5%DNCB(100 μL)刺激，于實(shí)驗(yàn)第三周至實(shí)驗(yàn)結(jié)束期間進(jìn)行中藥干預(yù)，每天早晚用棉簽涂擦相應(yīng)藥液一次，實(shí)驗(yàn)結(jié)束后摘眼球取血、并摘取脾臟及皮損用于檢測(cè)。

2.2 皮膚厚度測(cè)量 第29天實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)采用游標(biāo)卡尺測(cè)量每只小鼠皮膚厚度，測(cè)量時(shí)分別選取不同部位，測(cè)量五次計(jì)算平均值。

2.3 脾臟指數(shù) 取各組小鼠脾臟稱重，以每10 g小鼠的脾重作為脾臟指數(shù)，脾臟指數(shù)=[脾臟質(zhì)量(mg)/體重質(zhì)量(g)]×10。

2.4 HE染色 取各組小鼠皮損組織，置于中性甲醛中固定24 h。80%、90%、95%、無(wú)水乙醇梯度脫水，二甲苯透明，石蠟包埋，切片，HE染色，中性樹膠封片，光鏡下觀察。

2.5 酶聯(lián)免疫吸附法測(cè)定 取出備用的小鼠血清，嚴(yán)格按照IgE、IL-4、IL-6 ELISA試劑盒(聯(lián)科生物技術(shù)股份有限公司)說(shuō)明書操作，顯色終止立即在酶標(biāo)儀上測(cè)定吸光度值，制作標(biāo)準(zhǔn)曲線，按曲線換算樣品中IgE、IL-4、IL-6濃度。

2.6 半定量RT-PCR檢測(cè) 收集各組小鼠組織，采用TRIzol法提取皮損總RNA，根據(jù)Roche公司試劑盒進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄合成雙鏈cDNA。再以cDNA為模版，Real-time PCR實(shí)時(shí)檢測(cè)熒光強(qiáng)度。引物序列由生工生物工程有限公司合成。10 μL的PCR反應(yīng)體系包括2×PCR buffer 5 μL、ddH2O3μL、cDNA 1 μL、上下游引物各0.5 μL。PCR反應(yīng)條件為：95 ℃預(yù)變性30 s；95 ℃ 5 s，60 ℃ 30 s，40個(gè)循環(huán)；溶解曲線95 ℃ 5 s，60 ℃ 1 min，95 ℃ 1 s；冷卻50 ℃ 30 s，引物條件見(jiàn)下表。

表1 各目標(biāo)基因引物序列

2.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)及圖片制作采用GraphPad prism軟件和SPSS13.0軟件進(jìn)行分析，多組間均數(shù)的比較采用One-way ANOVA分析，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 藥物干預(yù)對(duì)DNCB誘導(dǎo)的小鼠模型的影響

3.1.1 小鼠皮損情況 連續(xù)觀察29 d，正常對(duì)照組背部皮膚無(wú)明顯變化，模型組前期經(jīng)DNCB高濃度(1%)刺激后出現(xiàn)水腫、紅斑、血痂，及搔抓，后期DNCB低濃度(0.5%)刺激后出現(xiàn)紅斑及鱗屑，經(jīng)中藥干預(yù)治療后可見(jiàn)紅斑淡化，無(wú)明顯的鱗屑及血痂(見(jiàn)圖2A)。

3.1.2 小鼠皮膚厚度 正常對(duì)照組皮膚厚度值為(0.508±0.01)mm，DNCB模型組皮膚厚度值為(1.46±0.19)mm，甘草組皮膚厚度值為(0.99±0.03)mm，馬齒莧組皮膚厚度值為(1.21±0.10)mm，配伍低劑量組皮膚厚度值為(1.23±0.13)mm，配伍高劑量組皮膚厚度值為(0.85±0.47)mm，和配伍低劑量組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)(見(jiàn)圖2B)。

3.1.3 脾臟指數(shù) 正常對(duì)照組脾臟指數(shù)為33.49±1.39，DNCB模型組脾臟指數(shù)為47.53±3.67，甘草組脾臟指數(shù)為37.81±1.58，馬齒莧組脾臟指數(shù)為44.06±1.01，配伍低劑量組為34.46±1.04，配伍高劑量組為33.96±2.41(見(jiàn)圖2C)，和配伍低劑量組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

3.2 藥物干預(yù)對(duì)背部皮膚組織形態(tài)學(xué)的影響 由圖3中HE染色結(jié)果可見(jiàn)，正常對(duì)照小鼠背部皮膚組織厚度正常，各層次清晰，幾乎無(wú)炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)；DNCB模型組皮膚組織表皮增厚，棘層和基底層有明顯的炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)，可見(jiàn)中性粒細(xì)胞、淋巴細(xì)胞，組織間隙水腫。中藥干預(yù)后各組皮膚組織厚度較模型組降低，炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)明顯減少，特別是甘草和馬齒莧配伍的高劑量組最為明顯。

3.3 ELISA檢測(cè)血清IgE和Th2型細(xì)胞因子的表達(dá) 產(chǎn)生IgE是濕疹的一個(gè)重要特點(diǎn)，應(yīng)用DNCB反復(fù)刺激的小鼠血清同正常對(duì)照組比較總IgE明顯升高(P<0.001)(見(jiàn)圖4A)；DNCB模型組的濃度為(774.82±22.60)ng/mL，和正常對(duì)照組為(546.13±14.31)ng/mL；應(yīng)用甘草組和馬齒莧可抑制IgE的升高，單獨(dú)用藥比較馬齒莧組優(yōu)于甘草組(P<0.01)，配伍高劑量(620.00±34.17)ng/mL的和配伍低劑量組(691.39±21.19)ng/mL比較無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。在血清Th2細(xì)胞因子IL-4的含量測(cè)定中(見(jiàn)圖4B)，DNCB模型組的濃度為(34.36±0.23)pg/mL，同空白組(31.88±0.29)pg/mL比較顯著提高(P<0.001)；藥物干預(yù)后可降低IL-4，單獨(dú)用藥馬齒莧組和甘草比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，配伍高劑量組(30.99±0.48)pg/mL抑制炎癥效果優(yōu)于配伍低劑量組(P<0.001)。前炎癥因子IL-6(見(jiàn)圖4C)空白組的濃度為(73.91±2.34)pg/mL，DNCB模型組濃度(143.26±1.27)pg/mL顯著升高(P<0.001)；甘草和馬齒莧干預(yù)后可減低血清IL-6，獨(dú)用藥比較甘草優(yōu)于馬齒莧(P<0.001)，配伍高劑量含量最低為(83.23±2.31)pg/mL，抑制炎癥效果優(yōu)于配伍低劑量組(P<0.001)。

3.4 Q-PCR檢測(cè)皮損中Th1/Th2型細(xì)胞因子的mRNA表達(dá) AD是以Th2型細(xì)胞因子優(yōu)勢(shì)表達(dá)為特點(diǎn)的慢性皮膚病，Th2胞分泌的IL-4、IL-5、IL-6、IL-13，本研究考察了Th1細(xì)胞分泌的IFN-γ，Th2胞分泌的IL-4、IL-6、IL-13炎癥因子的mRNA表達(dá)。結(jié)果如圖5見(jiàn)IL-4、IL-6、IL-13、IFN-γ炎癥因子DNCB組的表達(dá)同空白對(duì)照組比較有顯著性的提高(IL-4, IFN-γ,P<0.01；IL-6、IL-13,P<0.001)；單獨(dú)應(yīng)用甘草或馬齒莧都有不同程度的抑制炎癥因子表達(dá)的效果，且甘草組表現(xiàn)優(yōu)于馬齒莧組；配伍應(yīng)用后抑制炎癥的效果更佳，且配伍高濃度組的抑制效果均強(qiáng)于配伍低濃度組，在IL-13(P<0.05)和IL-6(P<0.001)的因子表達(dá)中配伍高劑量組同配伍低劑量組比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異；配伍高劑量組同DNCB組比較對(duì)IL-4、IL-6、IL-13、IFN-γ的抑制率分別為62.9%、93.0%、78.2%、53.0%。

4 討論

藥對(duì)配伍是中藥復(fù)方的最小單位，是根據(jù)藥物的性味歸經(jīng)、升降沉浮，選擇性地將兩味中藥進(jìn)行配對(duì)，其配伍蘊(yùn)涵著豐富的客觀規(guī)律。藥對(duì)配伍研究一直是傳統(tǒng)中藥研究的熱點(diǎn)，目前研究多以有效成分的含量測(cè)定為切入點(diǎn)，并結(jié)合現(xiàn)代藥理學(xué)、分子生物學(xué)、蛋白組學(xué)及代謝組學(xué)等方法深入闡明其作用機(jī)制及量效關(guān)系，揭示兩藥配伍內(nèi)在本質(zhì)和科學(xué)內(nèi)涵[8-9]。

AD的病因尚不清楚，發(fā)病機(jī)制十分復(fù)雜，免疫學(xué)發(fā)病機(jī)制認(rèn)為其與Th1/Th2免疫失衡有關(guān)。Th1細(xì)胞主要分泌IL-2、IFN-γ、TNF-α，并介導(dǎo)細(xì)胞免疫；Th2細(xì)胞主要分泌IL-4、IL-5、IL-13，并介導(dǎo)體液免疫[10-11]。參與AD發(fā)病的細(xì)胞因子眾多，促炎癥因子IL-6、IL-10也起到重要作用[12-13]。研究表明IgE的升高可引起皮膚的急慢性炎癥改變，血清中總IgE升高是AD的重要標(biāo)志，并且血清中與Th1、Th2相關(guān)[14]。此外，IL-4和IL-13可促進(jìn)B細(xì)胞的增殖和誘導(dǎo)B細(xì)胞生成IgE，在IgE的調(diào)節(jié)中起到重要作用[15]。基于此，本課題選擇了IgE、IL-4、IL-6、IL-13及 IFN-γ作為指標(biāo)進(jìn)行試驗(yàn)。

本實(shí)驗(yàn)以DNCB刺激誘導(dǎo)的AD小鼠模型為研究對(duì)象，局部應(yīng)用甘草和馬齒莧配伍的藥物，首先觀察其對(duì)AD炎癥反應(yīng)的影響。結(jié)果顯示，藥物干預(yù)后可改善臨床癥狀，尤其是兩種藥物配伍的高濃度組可顯著抑制皮膚增厚，降低脾臟指數(shù)。免疫器官是特異性免疫應(yīng)答的場(chǎng)所，該指數(shù)能夠在一定程度上反映機(jī)體的免疫功能狀態(tài)。因此，該結(jié)果表明甘草和馬齒莧配伍可以通過(guò)下調(diào)機(jī)體細(xì)胞免疫應(yīng)答和免疫器官臟器指數(shù)發(fā)揮一定的免疫抑制作用。結(jié)合AD的免疫學(xué)發(fā)病機(jī)制，進(jìn)一步檢測(cè)了 Th1/Th2相關(guān)細(xì)胞因子的表達(dá)水平，探討了甘草、馬齒莧兩味藥單獨(dú)和配伍應(yīng)用對(duì)模型小鼠的免疫調(diào)節(jié)作用，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，兩味藥單獨(dú)和配伍應(yīng)用均可減輕模型小鼠的臨床癥狀，改善皮損情況，抑制皮膚增厚，減輕炎癥，可抑血清IgE、IL-4、IL-6的升高，降低皮損中IL-4、IL-6、IL-13及IFN-γ細(xì)胞因子的mRNA的表達(dá)。研究發(fā)現(xiàn)配伍應(yīng)用后治療效果提高，并與給藥濃度有關(guān)，即配伍高劑量組優(yōu)于配伍低劑量組，但最佳配伍比例及藥物濃度有待進(jìn)一步研究。

綜上所述，本研究通過(guò)觀察臨床癥狀和組織形態(tài)學(xué)變化情況，以及檢測(cè)Th1/Th2相關(guān)細(xì)胞因子的表達(dá)水平，觀察了甘草、馬齒莧兩味藥對(duì)AD模型小鼠的治療作用，為臨床應(yīng)用提供了實(shí)驗(yàn)依據(jù)。