血管生成擬態(tài)及骨橋蛋白和基質(zhì)金屬蛋白酶2在三陰性乳腺癌組織中的表達(dá)及意義

劉 明，郭 滿，張 浩，李偉漢，張子杰

(1.新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院研究生處，河南 新鄉(xiāng) 453003；2.南陽市中心醫(yī)院乳腺外科，河南 南陽 473000；3.南陽市中心醫(yī)院病理科，河南 南陽 473000)

乳腺癌是我國女性常見的惡性腫瘤之一，發(fā)病率居女性惡性腫瘤首位，且逐年增長并趨于年輕化[1-4]。三陰性乳腺癌(triple negative breast cancer，TNBC)是雌、孕激素受體和人類表皮生長因子受體-2均不表達(dá)的乳腺癌亞型，其惡性程度高，預(yù)后差，復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移率高，病死率高[5]。MANIOTIS等[6]發(fā)現(xiàn)了一種不需要內(nèi)皮細(xì)胞參與而生成的腫瘤血管，被稱為血管生成擬態(tài)(vasculogenic mimicry，VM)，是多種實(shí)體惡性腫瘤的重要供血途徑[6-7]。骨橋蛋白(osteopontin，OPN)是一種分泌性鈣結(jié)合糖磷酸化蛋白，在骨組織礦化、細(xì)胞黏附、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、細(xì)胞免疫和血管再塑等方面具有多種生物功能，是一種多功能腫瘤調(diào)節(jié)蛋白[8]。研究顯示，OPN 下調(diào)對TNBC細(xì)胞自噬、凋亡活性有促進(jìn)作用[2]?；|(zhì)金屬蛋白酶(matrix metalloproteinases，MMP)-2是MMP中非常重要的一員，活化的MMP-2定位于細(xì)胞穿透基質(zhì)的突出部位，其在酶解細(xì)胞基質(zhì)中的作用尤為突出，幾乎能降解細(xì)胞外基質(zhì)中的各種蛋白成分，破壞腫瘤細(xì)胞侵襲的組織學(xué)屏障，在腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移中起關(guān)鍵性作用，在腫瘤浸潤轉(zhuǎn)移中的作用日益受到重視，被認(rèn)為是該過程中主要的蛋白水解酶[9]。目前，關(guān)于VM、OPN及MMP-2在TNBC組織中的表達(dá)、相互作用及與TNBC臨床病理特征關(guān)系的研究尚少。本研究通過觀察VM、OPN及MMP-2在TNBC組織中的表達(dá)情況，分析三者在TNBC組織中表達(dá)的臨床意義及相關(guān)性，探討其與TNBC發(fā)生、發(fā)展的關(guān)系。

1 資料與方法

1.1一般資料收集2012年1月至2015年12月南陽市中心醫(yī)院收治的120例首次經(jīng)病理檢查確診的女性TNBC患者的癌組織標(biāo)本為觀察對象，患者年齡28～76(51.86±9.11)歲，病歷資料及石蠟標(biāo)本完整，住院前均未行任何相關(guān)治療。另收集同期30例因良性乳腺增生行手術(shù)切除的組織標(biāo)本作為對照組，患者年齡18～60(40.77±10.90)歲。2組患者的年齡比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，具有可比性。

1.2主要試劑與儀器兔抗人MMP-2多克隆抗體、兔抗人OPN單克隆抗體及抗體稀釋液購自北京中杉生物技術(shù)有限公司，過碘酸-希夫(periodic acid-Schiff stain，PAS)反應(yīng)液套組購自北京博奧森生物技術(shù)有限公司，鼠抗人血小板-內(nèi)皮細(xì)胞黏附分子(platelet endothelial cell adhesion molecule-1，CD31)單克隆抗體及二氨基聯(lián)苯胺(diaminobenzidine，DAB)試劑盒(包括內(nèi)源性過氧化物酶封閉液、酶標(biāo)羊抗鼠/兔聚合物、20倍DAB濃縮底物及底物緩沖液)、磷酸鹽緩沖液(phosphate buffered saline，PBS)、枸櫞酸鹽緩沖液(抗原修復(fù)液，pH=6.0)購自鄭州賽諾特生物技術(shù)有限公司，中性樹膠購自上海滬試實(shí)驗(yàn)室器材股份有限公司；2235型石蠟切片機(jī)購自德國徠卡公司，PHY-3型攤片烤片機(jī)購自中威北化科技有限公司，DHG-9030A型恒溫鼓風(fēng)干燥箱購自東莞市科迪儀器有限公司，4 ℃低溫冰箱購自青島海爾集團(tuán)，bx-35型光學(xué)顯微鏡購自日本奧林巴斯公司。

1.3CD31及PAS雙重染色法檢測TNBC及良性乳腺增生組織中VM的表達(dá)2組標(biāo)本均行連續(xù) 3 μm 石蠟切片，60 ℃恒溫箱烤片2 h，二甲苯、梯度乙醇脫蠟復(fù)水，抗原修復(fù)，自然冷卻至室溫，三蒸水沖洗1 min，過氧化物酶封閉液室溫孵育30 min，PBS沖洗3次，正常山羊血清封閉液室溫孵育 20 min，PBS沖洗3次，除去PBS后分別加入一抗(鼠抗人CD31單克隆抗體)4 ℃過夜；PBS沖洗3次；滴加二抗(酶標(biāo)羊抗鼠/兔聚合物)室溫孵育 30 min，PBS沖洗3次，DAB顯色，于光學(xué)顯微鏡下控制顯色時間，待血管內(nèi)皮細(xì)胞著色后，終止染色；將切片置于過碘酸溶液中反應(yīng)10 min；蒸餾水沖洗，甩去多余水分，置于希夫液中，避光反應(yīng)15 min；蒸餾水沖洗3次；蘇木精復(fù)染細(xì)胞核，流水沖洗，鹽酸乙醇分化，蒸餾水沖洗返藍(lán)；梯度乙醇脫水、二甲苯透明，中性樹膠封片，光學(xué)顯微鏡下觀察有無VM。VM的典型表現(xiàn)為由腫瘤細(xì)胞模仿機(jī)體血管生成而形成的櫻桃紅色管道，內(nèi)壁無血管內(nèi)皮細(xì)胞襯附，管道中有紅細(xì)胞，周圍無明顯壞死及炎細(xì)胞浸潤。存在VM者判定為陽性，無VM者判定為陰性。

1.4免疫組織化學(xué)染色檢測TNBC及良性乳腺增生組織中OPN、MMP-2的表達(dá)2組標(biāo)本均行連續(xù)3 μm石蠟切片，60 ℃恒溫箱烤片2 h，二甲苯、梯度乙醇脫蠟復(fù)水，抗原修復(fù)，自然冷卻至室溫，三蒸水沖洗1 min，過氧化物酶封閉液室溫孵育30 min，PBS沖洗3次，正常山羊血清封閉液室溫孵育 20 min，PBS沖洗3次，加入一抗兔抗人MMP-2多克隆抗體或兔抗人OPN單克隆抗體4 ℃過夜；PBS沖洗3次；滴加二抗酶標(biāo)羊抗鼠/兔聚合物室溫孵育30 min，PBS沖洗3次；DAB室溫顯色5 min，三蒸水沖洗1 min，蘇木精復(fù)染 5 min，梯度乙醇脫水、透明，中性樹膠封片，顯微鏡觀察著色情況。OPN、MMP-2以細(xì)胞質(zhì)中出現(xiàn)棕色或棕黃色顆粒為陽性細(xì)胞。按半定量積分法判斷OPN、MMP-2表達(dá)情況，根據(jù)染色強(qiáng)度及陽性細(xì)胞所占比例計(jì)分，染色強(qiáng)度：未著色為0分，淺黃色為1分，深黃色為2分，深棕色為3分；陽性細(xì)胞百分率：在顯微鏡低倍鏡下選取典型的著色區(qū)域，高倍鏡下隨機(jī)選取10個視野，計(jì)算其平均陽性細(xì)胞百分率，平均陽性細(xì)胞百分率≤5% 為0分，6%～25%為1分，26%～49%為2分，≥50%為3分；2項(xiàng)評分相加，0～1分為陰性(-)，2分為弱陽性(+)，3～4分為陽性(++)， 5～6分為強(qiáng)陽性(+++)，(+)～(+++)均為陽性。

2 結(jié)果

2.1TNBC及良性乳腺增生組織中VM表達(dá)比較TNBC組織中VM陽性表達(dá)32例(26.7%)，良性乳腺增生組織中VM陽性表達(dá)0例(0.0%)。TNBC組織中VM陽性表達(dá)率明顯高于良性乳腺增生組織，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=10.169，P<0.05)。見圖1。

A：TNBC組織；B：良性乳腺增生組織；箭頭示VM。

圖1TNBC及良性乳腺增生組織中VM的表達(dá)(CD31、PAS染色，×400)

Fig.1ExpressionofVMinTNBCtissuesandbenignhyperplasiatissues(CD31andPASstaining，×400)

2.2TNBC及良性乳腺增生組織中OPN、MMP-2表達(dá)比較TNBC組織中OPN、MMP-2陽性表達(dá)分別為30例(25.0%)、86例(71.7%)。良性乳腺增生組織中OPN、MMP-2陽性表達(dá)分別為1例(3.3%)、5例(16.7%)。TNBC組織中OPN、MMP-2的陽性表達(dá)率顯著高于良性乳腺增生組織，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=6.872，30.425，P<0.05)。見圖2。

A：TNBC組織中OPN表達(dá)；B：良性乳腺增生組織OPN表達(dá)；C：TNBC組織中MMP-2表達(dá)；D：良性乳腺增生組織MMP-2表達(dá)。

圖2TNBC及良性乳腺增生組織中OPN和MMP-2的表達(dá)(免疫組織化學(xué)染色，×200)

Fig.2ExpressionofOPNandMMP-2inTNBCtissuesandbenignhyperplasiatissues(immunohistostaining，×200)

2.3VM、OPN及MMP-2的表達(dá)與TNBC臨床病理特征的關(guān)系結(jié)果見表1。VM、OPN及MMP-2在TNBC組織中的表達(dá)與腫瘤大小、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況和臨床分期有關(guān)(P<0.05)，與患者年齡、絕經(jīng)狀態(tài)及家族史無關(guān)(P>0.05)。

表1VM、OPN、MMP-2的表達(dá)與TNBC臨床病理特征的關(guān)系

Tab.1RelationshipbetweentheexpressionofVM，OPNandMMP-2andtheclinicopathologicalfeaturesofTNBC

臨床病理特征nVM+/例(%)-/例(%)χ2POPN+/例(%)-/例(%)χ2PMMP-2+/例(%)-/例(%)χ2P年齡 ≤35歲20(0.0)2(100.0)0.7400.3900(0.0)2(100.0)0.6780.410 2(100.0)0(0.0)0.8040.370 >35歲11832(27.1)86(72.9)30(25.4)88(74.6)84(71.2)34(28.8)腫瘤大小 T1493(6.1)46(93.9)2(4.1)47(95.9)23(46.9)26(53.1) T26827(39.7)41(60.3)18.9420.00026(38.2)42(61.8)20.5660.00061(89.7)7(10.3)25.6900.000 T332(66.7)1(33.3)2(66.7)1(33.3)2(66.7)1(33.3)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移 N0+N1 9610(10.4)86(89.6)68.8150.0007(7.3)89(92.7)80.2780.00064(66.7)32(33.3)5.9100.015 N2+N3 2422(91.7)2(8.3)23(95.8)1(4.2)22(91.7)2(8.3)臨床分期 I312(6.4)29(93.5)1(3.2)30(96.8)16(51.6)15(48.4) II6512(18.5)53(81.5)37.3860.00011(16.9)54(83.1)42.1000.00051(78.5)14(21.5)8.2820.016 III2418(75.0)6(25.0)18(75.0)6(25.0)19(79.2)5(20.8)絕經(jīng)狀態(tài) 是6618(27.3)48(72.7)0.0280.86816(24.2)50(75.7)0.0450.83246(69.7)20(30.3)25.6900.000 否5414(25.9)40(74.1)14(25.9)40(74.1)40(74.1)14(25.9) 家族史 有3210(31.2)22(68.7)0.4690.49411(34.3)21(65.6)2.0450.15323(71.9)9(28.1)0.0010.976 無8822(25.0)66(75.0)19(21.6)69(78.4)63(71.6)25(28.4)

2.4VM、OPN及MMP-2在TNBC組織中表達(dá)的相關(guān)性結(jié)果見表2。TNBC組織中VM與OPN、MMP-2表達(dá)呈正相關(guān)(r=0.609、0.296，P<0.05)，OPN與MMP-2表達(dá)呈正相關(guān)(r=0.192，P<0.05)。

表2VM、OPN及MMP-2在TNBC組織中表達(dá)的相關(guān)性

Tab.2CorrelationoftheexpressionofVM，OPNandMMP-2inbreastcancertissues

免疫組織化學(xué)指標(biāo)VM+/例-/例rPOPN+/例-/例rP MMP-2 +30560.2960.00126 600.1920.035 -2324 30OPN +22 80.6090.000 -1080

3 討論

乳腺癌是危害女性生命健康的常見腫瘤，近年來發(fā)病率不斷上升[10-12]。而TNBC是一種特殊類型的乳腺癌，占所有乳腺癌的15%～20%[13]。TNBC的侵襲性強(qiáng)，復(fù)發(fā)率高，治療方法有限，故預(yù)后較差[5]。VM是惡性腫瘤的一種重要的供血方式，為腫瘤細(xì)胞的生長提供更為充足的血液來源。XING等[14]研究表明，VM的表達(dá)與乳腺癌患者的生存率相關(guān)，VM陽性是乳腺癌的獨(dú)立生存危險因素。黃小環(huán)等[15]研究顯示，VM在乳腺癌組織中的表達(dá)與腫瘤大小、病理分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有密切聯(lián)系。本研究采用CD31與PAS雙重染色技術(shù)，同樣檢測到TNBC組織中存在VM，且VM陽性表達(dá)率與腫瘤大小、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況及臨床分期有關(guān)，而與患者年齡、絕經(jīng)狀態(tài)及家族史無關(guān)。

OPN作為一種多功能蛋白，在決定各種腫瘤的致癌潛能方面起著至關(guān)重要的作用，尤其在高侵襲性腫瘤中廣泛表達(dá)。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，下調(diào)OPN的表達(dá)可以通過多種通路促進(jìn)乳腺癌細(xì)胞的自噬和凋亡活性，從而抑制癌細(xì)胞的生長和轉(zhuǎn)移[2，16]，說明OPN在乳腺癌組織的增殖轉(zhuǎn)移過程中有重要作用。為進(jìn)一步探討OPN在乳腺癌組織侵襲中的作用是否與血管生成有關(guān)，本研究分析了TNBC組織中OPN表達(dá)及其與VM的關(guān)系，結(jié)果顯示，OPN在TNBC組織中高表達(dá)，并且與VM的表達(dá)呈正相關(guān)，說明OPN可能通過多種機(jī)制影響乳腺癌腫瘤血管的生成，從而增加腫瘤的侵襲性。

MMP-2為基質(zhì)金屬蛋白酶的重要成員，活化的MMP-2定位于細(xì)胞穿透基質(zhì)的突出部位，其在酶解細(xì)胞基質(zhì)的作用中尤為突出[9]。近年來，相關(guān)研究證實(shí)，MMP-2在腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移中起關(guān)鍵性作用。LI等[17]通過實(shí)時熒光反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)和免疫印跡法檢測2個乳腺癌細(xì)胞株(MDA-MB-231和MCF-7)和1個人正常乳腺細(xì)胞系(HS578Bst)中MMP-2的表達(dá)水平，結(jié)果顯示，MDA-MB-231和MCF-7細(xì)胞中MMP-2 mRNA和蛋白表達(dá)水平顯著高于HS578Bst細(xì)胞；同時免疫組織化學(xué)染色檢查乳腺癌患者組織標(biāo)本中MMP-2的表達(dá)，結(jié)果顯示，在乳腺癌組織中 MMP-2 表達(dá)水平與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、腫瘤分期相關(guān)。這與本研究結(jié)果一致，表明MMP-2在TNBC的侵襲轉(zhuǎn)移過程中起重要作用。

本研究相關(guān)性分析結(jié)果顯示，TNBC組織中VM與OPN、MMP-2表達(dá)呈正相關(guān)，OPN與MMP-2表達(dá)呈正相關(guān)，這與KANG等[18]對肝癌的研究結(jié)果一致，說明三者在惡性腫瘤的發(fā)生、發(fā)展及侵襲轉(zhuǎn)移過程中緊密聯(lián)系。

綜上所述，VM、OPN及MMP-2在TNBC組織中高表達(dá)，并在其發(fā)生、發(fā)展及侵襲轉(zhuǎn)移過程中起協(xié)同作用。同時檢測三者表達(dá)情況有助于判斷TNBC的增殖轉(zhuǎn)移特征，對TNBC的治療及預(yù)后判斷提供一定的理論依據(jù)。