引黃灌區(qū)不同種植年限紫花苜蓿土壤養(yǎng)分與細(xì)菌群落特征研究

張文文，劉秉儒，牛宋芳

(寧夏大學(xué)西北土地退化與生態(tài)恢復(fù)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室培育基地, 寧夏大學(xué)西北退化生態(tài)系統(tǒng)恢復(fù)與重建教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 寧夏 銀川 750021)

土壤微生物是土壤生態(tài)系統(tǒng)的重要組成部分，直接或間接參與土壤碳氮養(yǎng)分循環(huán)、土壤結(jié)構(gòu)的優(yōu)化、植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)等過程[1-4]，土壤細(xì)菌作為土壤微生物的主要成員，能夠快速高效地分解與轉(zhuǎn)化營養(yǎng)物質(zhì)[5]，影響植物對(duì)養(yǎng)分的獲取和土壤肥力[6]，同時(shí)細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)的差異和變化規(guī)律也能反映土壤現(xiàn)狀及變化趨勢(shì), 可用來指示土壤生態(tài)功能，因此土壤細(xì)菌群落和土壤養(yǎng)分關(guān)系的研究對(duì)引黃灌區(qū)紫花苜蓿(Medicagosativa)的生長(zhǎng)具有重要指導(dǎo)意義。高通量測(cè)序技術(shù)能夠全面系統(tǒng)的分析土壤細(xì)菌的多樣性，深度測(cè)序的性能是高通量測(cè)序技術(shù)的優(yōu)點(diǎn)所在[7]，也為本領(lǐng)域研究提供了極大的技術(shù)便利。

寧夏引黃灌區(qū)享引黃灌溉之利，水土光熱資源充足，農(nóng)業(yè)發(fā)達(dá)，灌溉歷史悠久，是全國12個(gè)商品糧基地之一[8-9]。因日照充足，有灌溉條件，寧夏成為全國最適合種植苜蓿的區(qū)域，截止2015年，紫花苜蓿種植面積已達(dá)40多萬hm2，干草產(chǎn)量達(dá)18～22 t·hm-2，為寧夏畜牧業(yè)帶來極大經(jīng)濟(jì)效益[10]。以往關(guān)于紫花苜蓿的研究主要集中在土壤養(yǎng)分變化，如楊恒山等[11-12]通過對(duì)不同種植年限紫花苜蓿土壤養(yǎng)分變化研究得到種植苜蓿對(duì)土壤理化性狀具有顯著影響，除pH外不同種植年限間差異明顯，任繼周[13]研究表明土壤有機(jī)質(zhì)和全氮含量隨著種植年限的增加而升高，但其增長(zhǎng)率隨種植年限的增加而降低。也有學(xué)者提出苜蓿地土壤養(yǎng)分增長(zhǎng)年限受區(qū)域影響，如黃土高原區(qū)土壤有機(jī)質(zhì)、全氮的變化表現(xiàn)為種植 5～10 年為增長(zhǎng)期[14]，干旱區(qū)表現(xiàn)為種植4年養(yǎng)分含量最高[15]。引黃灌區(qū)苜蓿種植最佳年限的探討尚有缺乏，且大多學(xué)者研究主要集中于土壤養(yǎng)分和團(tuán)粒結(jié)構(gòu)，在土壤微生物與土壤養(yǎng)分之間的互作關(guān)系等方面研究尚不清楚。鑒于此，本研究采用16S rRNA擴(kuò)增子測(cè)序技術(shù)研究了寧夏引黃灌區(qū)不同種植年限(1～6年)紫花苜蓿土壤細(xì)菌群落和土壤養(yǎng)分分布特征，旨在從微生物和養(yǎng)分等角度探討紫花苜蓿的最佳種植年限，為西北地區(qū)紫花苜蓿種植及持續(xù)高產(chǎn)提供科學(xué)指導(dǎo)。

1 材料與方法

1.1 研究區(qū)概況及樣品采集

研究區(qū)位于寧夏回族自治區(qū)銀川市(N 38°30′，E 106°06′)西夏區(qū)賀蘭山人工紫花苜蓿農(nóng)場(chǎng)。研究區(qū)海拔為1135 m，屬于溫帶大陸性季風(fēng)氣候，年平均氣溫為8.4 ℃，最高氣溫為38 ℃，最低氣溫為-20 ℃，年平均降水量約為200 mm，年蒸發(fā)量約為2250 mm，年平均日照時(shí)數(shù)為3075.5 h，無霜期為160 d，土壤類型為淡灰鈣土，地下水位約4～5 m[16]。

本研究分別以種植時(shí)間為1～6年(2012-2017年)的紫花苜蓿地為6個(gè)處理，每個(gè)處理設(shè)置3個(gè)面積30 m×30 m的小樣方作為3個(gè)重復(fù)，每個(gè)小樣方按照S型布點(diǎn)，清除掉地上凋落物和其他多余物質(zhì)，用直徑4 cm、高20 cm土鉆，采用5點(diǎn)混合法取0～20 cm土壤樣品，每個(gè)重復(fù)均取3個(gè)平行樣，6個(gè)處理共采集土樣54個(gè)。每個(gè)土樣采集2份，1份將鮮樣裝入經(jīng)高溫滅菌的凍存管并立即放入-196 ℃的液氮帶回室內(nèi)測(cè)定，另1份裝入自封袋帶回實(shí)驗(yàn)室自然風(fēng)干，并按照實(shí)驗(yàn)后期要求過篩用于土壤各項(xiàng)理化指標(biāo)測(cè)定。

1.2 測(cè)定方法

土壤理化指標(biāo)測(cè)定：采用水土比2.5∶1.0懸液測(cè)定土壤pH；采用水土比5∶1浸提液測(cè)定土壤電導(dǎo)率；采用重鉻酸鉀氧化-外加熱法測(cè)定土壤有機(jī)碳；采用凱式定氮法測(cè)定全氮；采用堿解擴(kuò)散法測(cè)定堿解氮；采用NaOH堿溶-鉬銻抗比色法測(cè)定全磷；采用NaHCO3浸提-鉬銻抗比色法測(cè)定速效磷[17]。

細(xì)菌總DNA的提取：土壤碾碎過0.18 mm篩后，首先采用十六烷基三甲基溴化銨(cetyltrimethylammonium ammonium bromide)或十二烷基苯磺酸鈉(sodium dodecyl sulfate)方法對(duì)樣本的基因組DNA進(jìn)行提取，用Qubit 2.0檢測(cè)DNA濃度，瓊脂糖凝膠檢測(cè)DNA完整性[18]。每個(gè)樣品3個(gè)重復(fù)，將同一樣品的土壤DNA混合，作為每份土壤樣品的總DNA。取適量的樣品于離心管中，使用無菌水稀釋樣品至1 ng·μL-1，以稀釋后的基因組DNA為模板，采用16S rRNA基因中的V4高變區(qū)引物515 F和806 R鑒定細(xì)菌多樣性，New England Biolabs公司的Phusion?High-Fidelity PCR Master Mix with GC Buffer和高效高保真酶進(jìn)行PCR擴(kuò)增，確保擴(kuò)增效率和準(zhǔn)確性，根據(jù)PCR產(chǎn)物濃度進(jìn)行等量混樣，充分混勻后使用2%的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)PCR產(chǎn)物，之后通過HiSeq 2500 PE 250進(jìn)行上機(jī)測(cè)序。下機(jī)數(shù)據(jù)采用prinseq去除低質(zhì)量的數(shù)據(jù)(reads)，然后根據(jù)下機(jī)得到的數(shù)據(jù)之間的overlap關(guān)系將成對(duì)的reads拼接成一條序列，為得到高質(zhì)量的reads，去除tags兩端的barcode引物序列，去除嵌合體及其短序列等后得到clean tags[19-20]。拼接過濾后的clean tags與物種注釋數(shù)據(jù)庫進(jìn)行比對(duì)檢測(cè)嵌合體序列，并最終去除其中的嵌合體序列[21]，得到最終的有效序列(effective tags)。

1.3 數(shù)據(jù)分析

利用Uparse軟件對(duì)序列進(jìn)行聚類，相似性定為0.97，操作分類單元被認(rèn)為可能接近于屬。用Qiime軟件(Version 1.9.1)中的blast方法與Unit數(shù)據(jù)庫進(jìn)行物種分類、細(xì)菌豐度及多樣性指數(shù)的計(jì)算、環(huán)境因子(土壤理化數(shù)據(jù))關(guān)聯(lián)分析和主成分分析(principle component analysis,PCA)，使用R軟件(Version 2.15.3)繪制PCA和環(huán)境因子分析熱圖。采用SPSS 19.0對(duì)土壤理化數(shù)據(jù)進(jìn)行方差分析和多重比較。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同種植年限苜蓿地土壤養(yǎng)分變化

由表1可知，研究區(qū)pH為 8.5～8.7，屬于堿性土壤。多重比較結(jié)果顯示，隨著種植年限的增加，土壤電導(dǎo)率、全磷和速效磷含量均無顯著變化；土壤、有機(jī)碳、全氮和堿解氮含量均表現(xiàn)為先降低后增高的趨勢(shì)，且在第5年達(dá)到最大，說明苜蓿地土壤養(yǎng)分隨著種植年限的增加可能會(huì)出現(xiàn)一個(gè)周期性的變化規(guī)律。

2.2 不同種植年限苜蓿地土壤OTU水平分析

對(duì)操作分類單位(operational taxonomic units，OTU)聚類和注釋結(jié)果顯示， 6個(gè)樣本得到的總tag數(shù)為518456，其中用于構(gòu)建OTUs并且獲得注釋信息的tags數(shù)為483980，占總數(shù)的95%；unclassified tags和頻數(shù)為1的unique tags是無法被聚類到OTUs的tags數(shù)目，共計(jì)24477，各樣本統(tǒng)計(jì)結(jié)果如表2所示。采用隨機(jī)抽樣方法抽取數(shù)據(jù)，隨機(jī)抽取它們所代表物種數(shù)目(即OTUs數(shù)目)，以抽取的測(cè)序數(shù)據(jù)量與對(duì)應(yīng)的物種數(shù)來構(gòu)建稀釋曲線。6個(gè)樣本的稀釋曲線如圖1所示，不同種植年限苜蓿地土壤細(xì)菌豐富程度表現(xiàn)為1 yr>5 yr>4 yr>3 yr>6 yr>2 yr。

表1 不同種植年限紫花苜蓿土壤理化性狀Table 1 Soil physical and chemical properties of alfalfa with different cultivation years (mean±SD, n=3)

注：同列不同字母表示差異顯著(P<0.05)。

Note: Different lowercase letters in the same column represent significant difference at theP<0.05 level.

表2 不同種植年限苜蓿地土壤OTU聚類和注釋情況統(tǒng)計(jì)Table 2 Statistics of soil OTU clustering and annotation in alfalfa fields with different cultivation years

2.3 不同種植年限苜蓿地土壤細(xì)菌組成分析

圖1 細(xì)菌稀釋曲線分析Fig.1 Analysis of bacterial dilution curve

2.3.1各樣地細(xì)菌群落在門水平上的組成和相對(duì)豐度 6個(gè)不同種植年限苜蓿地土壤樣品中細(xì)菌群落相對(duì)豐度前十的細(xì)菌門分別為：變形菌門(Proteobacteria) (44%)、酸桿菌門(Acidobacteria) (13%)、擬桿菌門(Bacteroidetes) (11%)、厚壁菌門 (Firmicutes) (4%)、放線菌門(Actinobacteria) (5%)、單胞菌門(Gemmatimonadetes) (6%)、疣微菌門(Verrucomicrobia) (3%)、浮霉菌門(Planctomycetes) (3%)、綠彎菌門(Chloroflexi) (2%)和奇古菌門(Thaumarchaeota) (0.2%)，共占細(xì)菌總數(shù)的91.2%。其中變形菌門、酸桿菌門和擬桿菌門占細(xì)菌總數(shù)的68%，說明這3個(gè)門的細(xì)菌為苜蓿地土壤樣本中較具優(yōu)勢(shì)的菌群。除厚壁菌門在6年中有大幅度的波動(dòng)變化外(相差10倍左右)，其余菌門變化幅度都較小，1～6年總體變化呈先升高后降低的變化趨勢(shì)，這與之前土壤有機(jī)質(zhì)、全氮和堿解氮變化趨勢(shì)正好相反(圖2)。

2.3.2各樣地細(xì)菌群落在目水平上的組成和相對(duì)豐度 目水平上細(xì)菌群落相對(duì)豐度前十的分析結(jié)果表明，相對(duì)豐度占比由高到低分別為unidentified_Gammaproteobacteria (18%)、殼聚糖目(Chitinophagales) (7%)、 unidentified_Acidobacteria (6%)、梭菌目(Clostridiales) (3%)、粘球菌目(Myxococcales) (5%)、單胞菌目(Gemmatimonadales) (4%)、噬纖維菌目(Cytophagales) (4%)、假單胞菌(Rhizobiales) (3%)、鞘脂單胞菌目(Sphingomonadales) (3%)、黃色單胞菌目(Xanthomonadales) (3%)，共占細(xì)菌總數(shù)56%。Unidentified_Gammaproteobacteria為目水平上優(yōu)勢(shì)菌，占了豐度前十菌群數(shù)的27%，其余各菌所占比例較為均勻(圖3)。

2.4 不同種植年限苜蓿地土壤細(xì)菌群落多樣性分析

2.4.1多樣性指數(shù)分析 不同種植年限苜蓿地土壤細(xì)菌多樣性指數(shù)分析結(jié)果表明，Shannon多樣性指數(shù)、Chao1指數(shù)和ACE指數(shù)在種植1年苜蓿地最大，分別為10.06、5157.33和5261.06，其中Shannon多樣性指數(shù)與其他各年限之間均無顯著性差異，Chao1指數(shù)與ACE指數(shù)表現(xiàn)為1 yr與2和6 yr間均存在顯著性差異，從大到小依次為1 yr>5 yr>4 yr>3 yr>2 yr>6 yr (表3)。

2.5 土壤環(huán)境因子與土壤細(xì)菌群落組成相關(guān)性分析

對(duì)土壤環(huán)境因子與土壤細(xì)菌門水平下豐度進(jìn)行 Spearman相關(guān)性分析，結(jié)果表明堿解氮、全氮和有機(jī)碳與一部分細(xì)菌門類存在顯著和極顯著相關(guān)性。有機(jī)碳與Candidatus_Magasanikbacteria、Candidatus_Yanofskybacteria具有極顯著負(fù)相關(guān)關(guān)系，與Hydrogenedentes、Candidatus_Peregrinibacteria、Melainabacteria具有顯著負(fù)相關(guān)關(guān)系；堿解氮與Candidatus_Peregrinibacteria具有極顯著負(fù)相關(guān)關(guān)系，與Candidatus_Yanofskybacteria、Parcubacteria具有顯著負(fù)相關(guān)關(guān)系；全氮與螺旋原蟲門(Spirochaetes)、硝化螺旋菌門(Nitrospirae)、無壁細(xì)菌門(Tenericutes)、放線菌門(Actinobacteria)、厚壁菌門(Firmicutes)具有顯著正相關(guān)關(guān)系，與浮霉菌門(Planctomycetes)、酸桿菌門(Acidobacteria)具有顯著負(fù)相關(guān)關(guān)系。全磷、電導(dǎo)率和pH與個(gè)別細(xì)菌門類存在顯著相關(guān)性(圖4)。

圖2 不同種植年限苜蓿地土壤細(xì)菌群落相對(duì)豐度前十的細(xì)菌門Fig.2 The first ten phylum of soil bacterial community in alfalfa field with different cultivation years

圖3 不同種植年限苜蓿地土壤細(xì)菌群落相對(duì)豐度前十的細(xì)菌目Fig.3 The first ten order of soil bacterial community in alfalfa field with different cultivation years

指數(shù) Index1 yr2 yr3 yr4 yr5 yr6 yrShannon10.06±0.12a9.80±0.17a9.90±0.23a10.01±0.04a9.96±0.04a9.81±0.24aChao15157.33±310.31a4467.96±230.03b4703.16±329.02ab4806.30±196.09ab5087.91±150.72a4395.99±457.96bACE5261.06±312.91a4538.10±255.48b4792.38±372.63ab4885.52±194.63ab5168.96±136.93a4466.54±457.52b

注：同行不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)。

Note: Different lowercase letters in the same line indicate significant difference (P<0.05).

2.6 土壤細(xì)菌群落間的主成分分析

主成分分析是一種對(duì)多維數(shù)據(jù)進(jìn)行降維，從而提取出數(shù)據(jù)中最主要的元素和結(jié)構(gòu)的方法。應(yīng)用PCA分析能夠提取出最大程度反映樣本間差異的兩個(gè)坐標(biāo)軸，從而將多維數(shù)據(jù)的差異反映在二維坐標(biāo)圖上。樣本在圖中的距離越接近，則它們的群落組成越相似。基于OTU水平的PCA分析結(jié)果表明，PC1和PC2的貢獻(xiàn)率分別為10.63%和9.32%。1和5 yr距離較近，2和6 yr距離較近，3和4 yr距離較近，即這3組間細(xì)菌群落組成相似性較高(圖5)。

圖4 土壤環(huán)境因子與細(xì)菌門水平相關(guān)性Fig.4 Correlation between soil environmental factors and bacterial level*表示顯著相關(guān)(P<0.05)，**表示及顯著相關(guān)(P<0.01)。* represents significant correlation at P<0.05 level, and ** represents significant correlation at P<0.01 level.

3 討論

圖5 細(xì)菌群落間的主成分分析Fig.5 PCA analysis among bacterial communities

通過對(duì)6個(gè)樣本門水平下細(xì)菌群落組成和相對(duì)豐度分析發(fā)現(xiàn)，苜蓿地土壤中主要有9類細(xì)菌，分別是變形菌門、酸桿菌門、擬桿菌門、厚壁菌門、放線菌門、芽單胞菌門、疣微菌門、浮霉菌門、綠彎菌門。其中郭麗麗等[22]研究發(fā)現(xiàn)疣微菌門的消失是油用鳳丹牡丹連作障礙形成的重要原因，而苜蓿地土壤中疣微菌門占細(xì)菌總數(shù)的3%，且隨著種植年限的增加變化較為穩(wěn)定，這可能是苜蓿未出現(xiàn)連作障礙的主要原因。羅明等[23]研究發(fā)現(xiàn)芽單胞菌門在黃河三角洲地區(qū)含量較高，為4.74%～5.69%，本研究中芽單胞菌門細(xì)菌豐度占比高達(dá)6%，但本研究區(qū)位于干旱區(qū)，其占比高可能是因?yàn)橐命S河水灌溉的結(jié)果。另外變形菌門、放線菌門和酸桿菌門是許多土壤細(xì)菌的3大優(yōu)勢(shì)門類[24-25]，且在本研究中發(fā)現(xiàn)這3大優(yōu)勢(shì)門類隨種植年限變化呈現(xiàn)出較為穩(wěn)定的變化趨勢(shì)。

土壤中數(shù)量眾多的微生物既是土壤形成過程的產(chǎn)物，也是土壤形成的推動(dòng)者[26]，因此它參與完成土壤中各種復(fù)雜的生化反應(yīng)過程[27]。Alpha多樣性可分析樣品內(nèi)菌種類別的豐富度和菌種數(shù)目的均勻度，Alpha多樣性越高，細(xì)菌種類越豐富，群落越穩(wěn)定[22]。本研究結(jié)果表明，Shannon指數(shù)并無顯著性變化，說明樣地土壤細(xì)菌群落均勻度較高，這與細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)組成具有相同特征，可能的原因是樣地為人工草場(chǎng)，具有相同的田間管理模式，因此細(xì)菌群落具有較好的均勻性。本研究Chao1指數(shù)和ACE指數(shù)以及物種豐度(稀釋曲線)隨著種植年限的遞增出現(xiàn)先減小后增大的變化率，即說明連作會(huì)導(dǎo)致細(xì)菌豐富度和多樣性下降，這與韓亞飛等[28]研究所得結(jié)果一致，并且在降低到一定程度又會(huì)有所回升，在第5年時(shí)達(dá)到最大值，南麗麗等[29]的研究結(jié)果支持這一結(jié)論。導(dǎo)致細(xì)菌群落豐富度和多樣性回升的可能原因是隨著種植時(shí)間的增加，土壤表面凋落物累積增多，從而導(dǎo)致土壤養(yǎng)分的回升，進(jìn)而導(dǎo)致細(xì)菌群落豐富度和多樣性增大。對(duì)各樣本細(xì)菌群落間進(jìn)行主成分分析表明，土壤細(xì)菌群落多樣性變化可能存在一個(gè)周期性規(guī)律，但由于研究時(shí)間只有6年，對(duì)周期持續(xù)時(shí)間研究缺乏數(shù)據(jù)支持，因此具體周期變化需要后續(xù)工作進(jìn)一步驗(yàn)證。

大量研究表明，土壤細(xì)菌多樣性與土壤理化性質(zhì)密切相關(guān)[30-31]。本研究將土壤理化指標(biāo)與門水平下細(xì)菌組成進(jìn)行Spearman相關(guān)性分析得到，有機(jī)碳與5類細(xì)菌呈顯著負(fù)相關(guān)關(guān)系，與其中兩類呈極顯著負(fù)相關(guān)關(guān)系，Liu等[32]發(fā)現(xiàn)中國東北黑土的細(xì)菌多樣性和有機(jī)碳呈負(fù)相關(guān)關(guān)系，Sul等[33]研究發(fā)現(xiàn)，有機(jī)碳含量低可能是導(dǎo)致微生物多樣性低的原因。硝化螺旋菌門參與土壤硝化[34]，本研究發(fā)現(xiàn)硝化螺旋菌門與土壤全氮具有顯著相關(guān)性。同時(shí)，紫花苜蓿共生固氮菌及其固氮能力的研究是土壤微生物學(xué)中的一個(gè)重要組成部分。在種植第二年的時(shí)候土壤堿解氮含量降到最低，可能原因是在生長(zhǎng)前期，紫花苜蓿需從土壤中吸收大量的氮素[35]。隨著種植年限的增加土壤氮素含量又呈現(xiàn)緩慢上升趨勢(shì)，這與豆科植物的固氮作用有很大關(guān)系，因此看來在一定閾值內(nèi)，紫花苜蓿種植年限越長(zhǎng)對(duì)土壤的改良效果越好；全氮、堿解氮也有不同程度增加，這與有關(guān)研究結(jié)論一致[36-37]。綜合來看，土壤理化性質(zhì)與土壤細(xì)菌之間確實(shí)存在一種互相反饋機(jī)制，且種植年限為5年時(shí)紫花苜蓿土壤養(yǎng)分和微生物環(huán)境同時(shí)達(dá)到最佳水平，但這種現(xiàn)象會(huì)呈周期性循環(huán)還是5年以后會(huì)持續(xù)下降需要進(jìn)一步研究。

4 結(jié)論

變形菌門、酸桿菌門、擬桿菌門和放線菌門是不同種植年限苜蓿地土壤優(yōu)勢(shì)菌群，酸桿菌門與土壤全氮具有極顯著正相關(guān)關(guān)系，放線菌門與土壤全氮具有顯著正相關(guān)關(guān)系；Shannon指數(shù)隨著種植年限增加無顯著性變化，種植時(shí)間為1～6年的紫花苜蓿地土壤細(xì)菌多樣性組成相似性高，且群落優(yōu)勢(shì)菌群不受種植時(shí)間的影響；土壤養(yǎng)分和土壤細(xì)菌群落組成及豐度都在種植5年時(shí)達(dá)到最大，土壤有機(jī)碳、堿解氮、全氮是影響細(xì)菌群落組成的主要環(huán)境因子。