橄欖果提取物對捆蹄抗氧化及抑菌作用研究

張迎陽，胡云青，鄒平，李麗娟，王宇

1(常州大學(xué) 食品學(xué)院，江蘇 常州,213164) 2(北京二商健力食品科技有限公司，北京,100000)

捆蹄作為我國傳統(tǒng)肉制品歷史悠久且加工過程精細(xì)，在全國范圍內(nèi)享譽(yù)盛名[1]；其加工原料為豬蹄髈肉及其他調(diào)味料，具有原料廉價、食用方便的特點(diǎn)，深受消費(fèi)者的喜愛[2]。近年來，隨著消費(fèi)者生活水平的提高，消費(fèi)市場對捆蹄的要求也逐漸增加，主要表現(xiàn)為在豐富產(chǎn)品風(fēng)味品質(zhì)及營養(yǎng)成分的同時，消費(fèi)者對捆蹄的食用品質(zhì)也提出了更高的要求[3]。但是，由于捆蹄產(chǎn)品脂質(zhì)含量高、水分活度大及腌制工藝等因素容易導(dǎo)致產(chǎn)品發(fā)生脂質(zhì)過氧化及微生物超標(biāo)等，從而影響產(chǎn)品品質(zhì)[4-6]。因此，調(diào)控捆蹄脂質(zhì)氧化及微生物生長，以適應(yīng)現(xiàn)代消費(fèi)理念，對促進(jìn)高溝捆蹄的發(fā)展具有重要的推動作用。橄欖果提取物是抗氧化和抑菌作用兼?zhèn)涞奶烊辉蟍7-8]。研究表明，橄欖果提取物中含有大量的酚類(單酚類、酚酸類、黃酮類、芪類)、三萜類、VC、胡蘿卜素等[9-11]，具有與合成抗氧化劑相當(dāng)?shù)目寡趸饔眉癉PPH自由基清除能力等，能顯著降低油脂中的氫過氧化物(hydroperoxide, HPOD)及丙二醛含量等[12-13]。另有研究表明，橄欖果提取物對食品中細(xì)菌、霉菌、酵母菌等均具有顯著的抑制作用，具有抗菌消炎、抗毒解毒的功效[14-15]。目前，橄欖果提取物的研究主要集中于成分分析、有效成分提取及體外作用探索方面[16-18]，在食品尤其是傳統(tǒng)肉制品中的應(yīng)用還未見報道。本研究以捆蹄為主要產(chǎn)品，分析不同橄欖果提取物添加量對捆蹄腌制及貯藏過程中的抗氧化、抑菌的效果及對捆蹄品質(zhì)的影響，以期為捆蹄及傳統(tǒng)肉制品的抗氧化及抑菌提供理論指導(dǎo)。

1 材料與方法

1.1 材料與設(shè)備

豬后蹄肉(同批豬肉，豬齡11個月)，淮安蘇食肉品有限公司；橄欖果提取物,上海一基生物試劑有限公司；食鹽、香辛料及調(diào)味料均為高溝市售；生化試劑如硫代巴比妥酸(thiobarbituric acid,TBA)等,國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

HH-W420數(shù)顯三用恒溫水箱,江蘇省金壇市榮華儀器制造有限公司；Beckman Allegra 64R冷凍離心機(jī),美國貝克曼庫爾特有限公司；2300型Kjeltec 101-O-S電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱,上海躍進(jìn)醫(yī)療器械廠；SPX-250C型恒溫恒濕箱,上海博訊實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠；IKA T18 basic型高速勻漿機(jī),美國Beckman Coulter公司；UV-2600型紫外分光光度計(jì),日本島津公司；CR-400便攜式色差儀,日本Konica Minolta公司；TA.XTPlus物性測試儀,英國Stable Micro System。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 工藝流程

捆蹄加工工藝如下：

原料肉→清洗切碎→修整→腌制→捆扎→蒸煮→冷卻包裝

具體工藝加工點(diǎn)：腌制，將配置好的香辛料及調(diào)味料等與碎肉混勻(對照組與實(shí)驗(yàn)組所采用的基本配方一致：每1 kg肉中添加大料粉5 g、花椒粉5 g、胡椒粉3 g、食鹽40 g、雞精20 g)，在所需的溫度條件下腌制；捆扎，將腌制好的原料肉用腸衣包裹，用長約20 cm經(jīng)蒸煮消毒過的麥草繩將包裹好的捆蹄先扎緊(間距約2 cm)成圓形蹄髈形狀(捆蹄直徑約4 cm)。在100 ℃蒸煮鍋中煮制0.5 h后將溫度降至90 ℃繼續(xù)蒸煮0.5 h，蒸煮完后靜止2 h，出鍋冷卻包裝。

1.2.2 實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)

根據(jù)1.2.1工藝流程，分別在捆蹄腌制階段添加質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0、100、200、300 mg/kg的橄欖果提取物，分析不同添加量的橄欖果提取物對捆蹄在4 ℃腌制1 d和貯藏7、14、21、28 d時的抗氧化(羰基值、POV值、TBARS值)、抑菌(菌落總數(shù)、酵母菌、金黃色葡萄球菌、腸桿菌)及其他品質(zhì)特性(色差、質(zhì)構(gòu))。

1.2.3 方法測定

(1)羰基值測定[19]：沿樣品切面中切除20 g左右的肉，剔除肌筋及可見脂肪，絞碎混勻后，再精確稱取5.000 g樣品加入pH值6.5的磷酸緩沖液10 mL(含0.6 mol/L的NaCl)于高速勻漿機(jī)中勻漿2次，各30 s。取2份勻漿液0.2 mL于試管中，并且加入1 mL質(zhì)量分?jǐn)?shù)為10%的TCA溶液，將上述溶液于12 000 r/min條件下冷凍離心5 min，棄去上清液。在其中1份沉淀中加入1 mL 2 mol/L的HCl溶液，另1份加入1 mL含有質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.2%DNPH的2 mol/L的HCl溶液，混勻后在20 ℃條件下反應(yīng)1 h。然后再分別往上述2種溶液加入1 mL質(zhì)量分?jǐn)?shù)為10%的三氯乙酸(TCA)溶液，并于12 000 r/min條件下冷凍離心5 min，棄去上清液后，加入1 mLV(乙醇)∶V(乙酸乙酯)=1∶1混合物，并于12 000 r/min條件下冷凍離心5 min，棄去上清液，并重復(fù)3次。往最終得到的沉淀中加入2 mL 6 mol/L的鹽酸胍溶液(溶于pH為6.5的20 mmol/L磷酸鈉緩沖溶液)，混勻后于12 000 r/min條件下離心2 min，棄去雜質(zhì)。加入HCl的樣品于280 nm處測定其吸光值，結(jié)果用于蛋白濃度的測定；加入二硝基苯腙(dinitrophenylhy drazone, DNPH)的樣品于370 nm處測定吸光值，結(jié)果用于羰基值的測定。用牛血清蛋白做標(biāo)準(zhǔn)曲線，結(jié)果以1 mg蛋白質(zhì)中所含的羰基量(mmol)來表示。

(2)POV值測定[20]：沿樣品切面中切除20 g左右的肉，剔除肌筋及可見脂肪，絞碎混勻后，再精確稱取5.000 g置于250 mL的碘量瓶中，加入V(氯仿)∶V(冰乙酸)=2∶1混合液25 mL，加塞搖動，使其充分溶解，然后精確加入0.5 mL飽和KI溶液，置于15～25 ℃的暗處，避光靜置5 min后，取出加入75 mL蒸餾水，搖勻后馬上用0.01 mol/L硫代硫酸鈉標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行滴定，臨近終點(diǎn)時,加入0.5 mL淀粉指示劑，繼續(xù)滴定并強(qiáng)烈振搖直到藍(lán)色消失。過氧化值計(jì)算如公式(1)所示：

(1)

式中：V1，樣品消耗硫代硫酸鈉標(biāo)準(zhǔn)溶液的體積，mL；V2，空白試驗(yàn)消耗硫代硫酸鈉標(biāo)準(zhǔn)溶液的體積，mL；c，硫代硫酸鈉溶液的標(biāo)定濃度，mol/L；m，樣品的質(zhì)量，g。

(3)TBARS值測定[21]：稱取5.000 g樣品于80 mL離心管中，分別加入25 mL質(zhì)量分?jǐn)?shù)20% TCA、20 mL雙蒸水，在冰浴中以3 000 r/min高速均質(zhì)60 s，然后在2 000 g、4 ℃下離心10 min，上清液過濾，濾液用雙蒸餾水定容到50 mL。取2 mL濾液，加入2 mL 0.02 mol/L TBA溶液在沸水浴中反應(yīng)20 min，反應(yīng)結(jié)束后冷卻，測定其532 nm處吸光度值。空白樣的制備：25 mL 20% TCA用雙蒸水定容到50 mL，然后取2 mL濾液加2 mL TBA。TBARS值通過標(biāo)準(zhǔn)曲線來計(jì)算，結(jié)果表示為mg丙二醛(MDA)/kg肌肉。

(4)微生物測定：無菌條件下稱取樣品20 g，用無菌剪刀剪碎，置于180 mL無菌生理鹽水的無菌均質(zhì)袋中，用拍擊式均質(zhì)器拍打1～2 min，即為質(zhì)量濃度0.1 g/mL稀釋液。按照遞度制取10 倍系列遞增稀釋液。選擇3個合適的稀釋度，吸取0.1 mL稀釋液于無菌培養(yǎng)皿中，3個平行，然后將涼至50℃左右的不同培養(yǎng)基注入無菌培養(yǎng)皿中，適當(dāng)搖勻，待凝固后，于適當(dāng)?shù)臈l件下倒置培養(yǎng)1～2 d。同一稀釋度的3個培養(yǎng)皿的菌落平均數(shù)乘以稀釋倍數(shù)，即為每克樣品中所含微生物的數(shù)目。具體的培養(yǎng)條件見表1。

表1 培養(yǎng)條件Table 1 Culture conditions

(5)色差(L*、a*、b*)測定[22]：采用標(biāo)準(zhǔn)版對設(shè)備進(jìn)行校正(Y=94.0，x=0.315 6，y=0.332 1)，然后通過D65光源，8 mm直徑測量范圍和2°視角測定產(chǎn)品表面的顏色。其中亮度用L*表示，紅度用a*表示，黃度用b*表示。

(6)質(zhì)構(gòu)測定[23]：

用圓柱形取樣器和雙面刀將肉餅切成高1 cm，直徑2.5 cm的圓柱體樣品，在室溫下用物性質(zhì)構(gòu)儀對其進(jìn)行測定。測定參數(shù)為：探頭型號P/50，測前及測中速度均為2 mm/s，測后速度為5 mm/s，壓縮比例為50%，觸發(fā)力5 g，測試間隔時間為5 s。測試結(jié)果采用TPA-macro進(jìn)行分析[24]。

1.2.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)及分析

所有數(shù)據(jù)利用Microsoft Excel進(jìn)行統(tǒng)計(jì)處理，用SAS 9.2進(jìn)行ANOVA分析，不同平均值之間利用LSD法進(jìn)行差異顯著性檢驗(yàn)。

2 結(jié)果與分析

2.1 橄欖果提取物對捆蹄抗氧化作用

2.1.1 羰基值變化

從表2可以看出，捆蹄在腌制及貯藏過程中羰基含量顯著增加(P<0.05)，并且橄欖果提取物能顯著降低(P<0.05)捆蹄在腌制及貯藏過程中的羰基值；在腌制1 d及貯藏過程中，隨著橄欖果提取物添加量的增加，捆蹄在腌制及貯藏過程中羰基值顯著(P<0.05)降低，當(dāng)橄欖果提取物添加量達(dá)到200～300 mg/kg時，不同階段捆蹄中的羰基含量無顯著差異(P<0.05)。說明橄欖果提取物能顯著的抑制捆蹄中脂質(zhì)及蛋白質(zhì)的氧化，有效提高產(chǎn)品品質(zhì)，并且當(dāng)橄欖果提取物添加量大于200 mg/kg時有最佳的抑制效果。

表2 橄欖果提取物對捆蹄羰基值抑制結(jié)果 單位：nmol/g

注：同行不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)；同列不同大寫字母表示差異顯著(P<0.05)。

2.1.2 POV值變化

POV值是衡量動物油脂脂質(zhì)初級氧化程度的主要指標(biāo)，通過測定產(chǎn)品中的過氧化物含量來表示，是評價干腌肉制品脂質(zhì)氧化程度及品質(zhì)的重要指標(biāo)。圖1為不同橄欖果提取物對捆蹄加工及貯藏過程中初級氧化的作用結(jié)果?？梢钥闯?，在腌制及貯藏過程中，捆蹄中的POV值顯著增加，對照組在貯藏28 d時POV值達(dá)到1.35 mg/kg；隨著橄欖果提取物添加量的增加，不同階段捆蹄中的初級氧化產(chǎn)物不斷降低，主要表現(xiàn)為當(dāng)橄欖果提取物添加量大于300 mg/kg時，與對照組相比，捆蹄在腌制及貯藏過程中POV值均有大幅度降低，并且在貯藏28 d后，POV值僅為0.95 mg/kg。因此可以看出，橄欖果提取物能顯著抑制捆蹄中脂質(zhì)的初級氧化，降低產(chǎn)品中的過氧化物，從而有效提高產(chǎn)品品質(zhì)。

圖1 橄欖果提取物對捆蹄POV值抑制效果Fig.1 Inhibition results of olive fruit extract on POV values of bundle hoof

2.1.3 TBARS值變化

TBARS是衡量肉制品中二次氧化的重要指標(biāo)，以肉制品中丙二醛含量表示。從圖2可以看出，隨著橄欖果提取物的增加，捆蹄中TBARS呈顯著的(P<0.05)降低趨勢，腌制1d后，橄欖果提取物添加量在100～300 mg/kg時，不同階段捆蹄中的TBARS均顯著(P<0.05)低于對照組；并且當(dāng)橄欖果提取物添加量為300 mg/kg時，捆蹄在加工及貯藏過程中TBARS值均低于0.5 mg/kg，與對照組相比，具有良好的質(zhì)量安全品質(zhì)。

圖2 橄欖果提取物對捆蹄TBARS抑制效果Fig.2 Inhibition results of olive fruit extract on TBARS values of bundle hoof

通過橄欖果提取物對捆蹄腌制及貯藏過程中羰基含量、POV值、TBARS值的作用結(jié)果可以看出，橄欖果提取物對捆蹄中的蛋白質(zhì)氧化及脂質(zhì)氧化均有顯著的抑制作用，并且隨著添加量的增加，該抑制作用不斷增加，并且當(dāng)添加量為300 mg/kg時有最佳的抑制作用。

2.2 橄欖果提取物對捆蹄抑菌作用研究

2.2.1 菌落總數(shù)變化

目前，大部分研究報道均認(rèn)為橄欖果提取物對大腸桿菌、沙門氏菌、綠膿假單胞菌等革蘭氏陰性菌及金黃色葡萄球菌等革蘭氏陽性菌都具有顯著抑制作用[10,14-15]。從圖3可以看出，不同處理組捆蹄在貯藏過程中菌落總數(shù)均呈顯著的(P<0.05)增加趨勢，在貯藏28 d時達(dá)到6.14(lg CFU/g)，發(fā)生腐敗變質(zhì)。但是，隨著橄欖果提取物添加量的增加，捆蹄中的菌落總數(shù)不斷降低，當(dāng)添加量為300 mg/kg有最佳的效果，并且在該添加條件下，產(chǎn)品在貯藏28 d時菌落總數(shù)僅為4.52(lg CFU/g)，顯著低于對照組。因此可以看出，橄欖果提取物對捆蹄加工及貯藏有良好的抑菌作用。

圖3 橄欖果提取物對捆蹄菌落總數(shù)抑制結(jié)果Fig.3 Inhibition results of olive fruit extract on the total number colonies of bundle hoof

2.2.2 乳桿菌、腸桿菌變化

表3為不同橄欖果提取物對捆蹄中乳酸菌、腸桿菌的抑制作用結(jié)果。

表3 橄欖果提取物對捆蹄微生物抑制結(jié)果Table 3 Inhibition results of olive fruit extract on the microorganisms of bundle hoof

注：同行小寫字母不同表示差異顯著(P<0.05)；同列大寫字母不同表示差異顯著(P<0.05)。下同。

從表3中可以看出，隨著腌制及貯藏時間的延長，捆蹄中的2種微生物呈顯著增加(P<0.05)趨勢。但是隨著橄欖果提取物添加量的增加，對2種菌在不同階段均呈現(xiàn)顯著的(P<0.05)抑制作用。橄欖果提取物添加量在100～300 mg/kg，腌制1 d后，乳酸菌數(shù)量隨貯藏期延長呈降低趨勢，并且隨著橄欖果提取物添加量的增加，該抑制作用不斷增加；當(dāng)添加量為300 mg/kg時，捆蹄在貯藏28 d后乳酸菌僅為4.08(lg CFU/g)，顯著低于對照組。對于腸桿菌，橄欖果提取物對其抑制作用與乳酸菌相似，均表現(xiàn)為隨著橄欖果提取物添加量的增加，該抑制作用不斷增加；當(dāng)添加量為300 mg/kg時，抑制作用最強(qiáng)。

綜合上述分析結(jié)果可以看出，橄欖果提取物對捆蹄中微生物有明顯的抑制作用，并且隨著橄欖果提取物添加量的增加，其抑制作用不斷增加，當(dāng)添加量為300 mg/kg時，能有效地抑制捆蹄中微生物生長，從而延長捆蹄的保鮮期。主要原因是橄欖果提取物中的酚類(單酚類、酚酸類、黃酮類、芪類)、三萜類、花青素等活性成分可以通過抑制與微生物代謝相關(guān)的酶活性(如脫氫酶)，從而影響微生物的代謝過程[9,11]。

2.3 橄欖果提取物對捆蹄色差影響

從表4可以看出，橄欖果提取物對腌制階段的捆蹄顏色(L*、a*、b*)無顯著(P>0.05)影響；但是在貯藏28 d后，添加量為200～300 mg/kg處理組捆蹄色差顯著高于對照組(P<0.05)，可能與橄欖果提取物中含有的花青素有關(guān)[13]。結(jié)果表明,當(dāng)橄欖果提取物添加量為200～300 mg/kg時，在捆蹄中具有穩(wěn)定肉色的作用。

表4 橄欖果提取物對捆蹄色差影響結(jié)果Table 4 Effect of olive fruit extract on the color bundle hoof

2.4 橄欖果提取物對捆蹄質(zhì)構(gòu)影響

從表5可以看出，雖然不同處理組捆蹄硬度、彈性、內(nèi)聚性、咀嚼性在加工貯藏過程中不斷變化，但是不同橄欖果提取物對捆蹄質(zhì)構(gòu)特性無顯著(P>0.05)影響。

表5 橄欖果提取物對捆蹄質(zhì)構(gòu)影響結(jié)果Table 5 Effect of olive fruit extract on the texture of bundle hoof

3 結(jié)論

實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，橄欖果提取物不僅能有效地抑制捆蹄加工及貯藏過程中的蛋白質(zhì)氧化及脂質(zhì)初級、二次氧化，而且對捆蹄中微生物生長有顯著的(P<0.05)抑制作用。具體表現(xiàn)為，當(dāng)捆蹄中橄欖果提取物添加量在200～300 mg/kg時，在腌制及貯藏過程中羰基值、POV值及TBARS結(jié)果顯著(P<0.05)低于對照組；并且在該添加范圍內(nèi)，捆蹄中的菌落總數(shù)明顯降低，乳酸菌及腸桿菌數(shù)量也顯著(P<0.05)低于對照組。橄欖果提取物(100～300 mg/kg)對捆蹄具有護(hù)色的作用，并且對其質(zhì)構(gòu)特性無顯著(P>0.05)的影響。因此，橄欖果提取物可延長捆蹄保質(zhì)期至28 d。