藍(lán)色和紫色小麥多酚提取物的體外抗氧化活性評(píng)價(jià)

劉富明，母婷婷，王彩霞*，李誠(chéng)，蒲至恩

1(四川農(nóng)業(yè)大學(xué) 食品學(xué)院，四川 雅安，625014) 2(四川農(nóng)業(yè)大學(xué) 農(nóng)學(xué)院，四川 成都，611130)

彩色小麥?zhǔn)俏覈?guó)雜交培育的特色小麥，因其較高的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值和保健功能[1-2]，深受消費(fèi)者的關(guān)注。部分研究證實(shí)有色谷物的抗氧化活性高于普通品種，這與谷物籽粒中酚類化合物的存在密切相關(guān)[3]。

多酚是植物化學(xué)元素的統(tǒng)稱，因具有極強(qiáng)的抗氧化能力，能夠有效地保護(hù)體內(nèi)生物大分子免受氧化損傷[4-5]。酚類常以不可溶性和可溶性共軛形式存在[6]，根據(jù)提取方法和結(jié)合方式的不同，主要分為游離酚和結(jié)合酚[7]。目前已有較多雜糧谷物中酚類的研究，如延莎等[8]證實(shí)了不同米色小米多酚對(duì)自由基有較好的清除效果。王鵬等[9]研究了雜糧多酚提取物的抗氧化能力，發(fā)現(xiàn)酚類含量及結(jié)構(gòu)中酚羥基數(shù)量決定抗氧化能力。申迎賓等[10]采用不同溶劑進(jìn)行青稞多酚提取及抗氧化研究，發(fā)現(xiàn)青稞酚含量與抗氧化效果顯著相關(guān)。當(dāng)前谷物酚類的研究大多僅關(guān)注游離酚的含量及抗氧化活性，往往忽略對(duì)結(jié)合酚的研究[11-12]。本試驗(yàn)選取彩色小麥中的藍(lán)色和紫色小麥作原料，分別提取游離酚和結(jié)合酚，并對(duì)其體外抗氧化活性進(jìn)行研究，以期為彩色小麥資源的開(kāi)發(fā)利用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

藍(lán)色小麥(蜀藍(lán)麥1701)、紫色小麥(蜀紫麥1701)、普通小麥(蜀麥969)，四川農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院提供，麥樣清洗除雜后置于40 ℃干燥箱中4 h烘干，粉碎過(guò)100目篩備用；無(wú)水乙醇、甲醇、丙酮、正己烷、濃H2SO4、乙酸乙酯、福林酚試劑、Na2CO3、鄰苯三酚、水楊酸等試劑均為分析純,雅安萬(wàn)科化學(xué)試劑；沒(méi)食子酸,純度≥ 99%，成都科龍化工試劑；二苯基苦肼基自由基(DPPH),純度≥ 99%，美國(guó)sigma。

1.2 儀器設(shè)備

超聲波清洗器(410HT)，深圳科利爾電子科技有限公司；旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器(RE52CS-1)，上海亞榮生化儀器公司；冷凍離心機(jī)(ST26R)，北京聯(lián)合科力科技有限公司；酶標(biāo)儀(nfinite M200)，瑞士TECAN公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 游離酚提取[13]

準(zhǔn)確稱取1 g小麥粉，以60%乙醇、60%甲醇和60%丙酮為溶劑，在料液比1∶20(g∶mL)50 ℃下超聲(功率240 W)提取10 min，再經(jīng)真空抽濾，45 ℃旋蒸后濃縮液于-20 ℃保存待測(cè)。

1.3.2 結(jié)合酚提取[14]

將已提取過(guò)游離酚后的小麥殘?jiān)?∶20(g∶mL)加入正己烷，振蕩后離心(4 000 r/min，5 min)，棄上清液，加入20 mL質(zhì)量濃度為10%的硫酸，75 ℃水浴1 h，再分別加入20 mL乙酸乙酯萃取5次，離心(4 000 r/min，5 min)，合并萃取相后于45 ℃下旋蒸，將殘余物定容，0.45 μm濾膜過(guò)濾，得到濃縮液-20 ℃保存待測(cè)。

1.3.3 多酚含量測(cè)定

福林酚法[15-16]

1.3.4 體外抗氧化實(shí)驗(yàn)

1.3.4.1 清除DPPH自由基能力測(cè)定

參考文獻(xiàn)[17]略修改。將DPPH配成0.2 mmol/L，避光備用。將樣品和DPPH按體積比1∶1混勻，室溫避光30 min，于517 nm處測(cè)吸光值，空白組以DPPH代替樣品，對(duì)照以無(wú)水乙醇代替DPPH，重復(fù)測(cè)定3次。按公式(1)計(jì)算DPPH清除率：

(1)

式中：I表示自由基清除率，%；A1表示樣品吸光度；A2表示對(duì)照吸光度；A3表示空白吸光度。

1.3.4.2 清除ABTS自由基能力測(cè)定

參考文獻(xiàn)[18]略修改。將2.6 mmol/L的過(guò)硫酸鉀與7.4 mmol/L ABTS溶液按體積比1∶1混合，置于避光室溫下16 h，在734 nm下用磷酸鹽緩沖液調(diào)吸光度為0.7±0.002。將0.1 mL樣品與5 mL ABTS混勻，室溫避光20 min后，在734 nm下測(cè)吸光度值?？瞻滓哉麴s水代替樣品，對(duì)照以蒸餾水代替ABTS。按式(1)計(jì)算ABTS清除率。

1.3.4.3 清除超氧陰離子自由基能力測(cè)定

參考文獻(xiàn)[19]略修改。 取50 mmol/L的Tris-HCl緩沖液和1 mmol/L的EDTA溶液各1 mL與1.5 mL樣品混合，加入1 mL 0.4 mmol/L鄰苯三酚，混勻，靜置10 min，加入100 mmol/L二硫蘇糖醇30 μL終止反應(yīng)，在1 h內(nèi)于325 nm下測(cè)吸光值，空白以蒸餾水代替樣品，對(duì)照以蒸餾水代替鄰苯三酚溶液。按式(1)計(jì)算超氧陰離子清除率。

1.3.4.4 清除羥自由基能力測(cè)定

參考文獻(xiàn)[20]。

1.3.4.5 總還原力測(cè)定

參考文獻(xiàn)[21]。

1.3.4.6 數(shù)據(jù)分析

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)為3次重復(fù)實(shí)驗(yàn)的平均值，以SPSS 19.0軟件Duncan法進(jìn)行差異顯著性分析，采用Excel 2016作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 提取方法對(duì)小麥多酚得率的影響

游離酚和結(jié)合酚提取結(jié)果如圖1所示，幾種提取溶劑中60%的乙醇溶液對(duì)游離酚提取效率高于甲醇和丙酮(圖1-a)。根據(jù)相似相溶原理，選60%的乙醇作為游離酚提取溶劑，得到藍(lán)色小麥、紫色小麥及普通小麥游離酚含量依次為：(1 000±21)、(950±19)、(758±23) μg/g。將60%乙醇提取過(guò)游離酚后收集的麥渣經(jīng)水解提取結(jié)合酚，得到結(jié)合酚含量依次為：(1 130±28)、(1 020±26)、(869±20) μg/g (圖1-b)。綜上，藍(lán)色小麥和紫色小麥的多酚含量顯著高于普通小麥，這與ARRANZ[22]和徐元元[23]等結(jié)論保持一致。

a-游離酚;b-結(jié)合酚圖1 小麥樣品中酚類含量Fig.1 Polyphenol contents in wheat注：不同字母表示差異顯著(P<0.05)

2.2 DPPH自由基清除能力

DPPH是性質(zhì)穩(wěn)定的自由基，參與生命活動(dòng)，自由基過(guò)量易引起氧化應(yīng)激，提高發(fā)病率。研究表明,抗氧化劑對(duì)DPPH清除依賴其供氫能力，DPPH接受抗氧化劑的氫原子使奇數(shù)電子的氮原子減少，促使體系中自由基降低[24]。由圖2可知，樣品中游離酚和結(jié)合酚對(duì)DPPH均有較好清除效果，隨質(zhì)量濃度增加DPPH清除率增強(qiáng)，清除DPPH強(qiáng)弱順序?yàn)樗{(lán)色小麥、紫色小麥、普通小麥。當(dāng)小麥質(zhì)量濃度在40 mg/mL時(shí)，藍(lán)色小麥、紫色小麥及普通小麥游離酚的DPPH清除率依次為：(77.4±2.9)%、(71.2±3.3)%、(66.1±2.7)%，其IC50值依次為：14.7、24.1、28.5 mg/mL；結(jié)合酚DPPH清除率依次為：(90.1±2.2)%、(89.2±1.9)%、(86.3±2.3)%，其IC50值依次為：7.3、8.4、10.1 mg/mL。3組樣品中結(jié)合酚的IC50值均低于游離酚，說(shuō)明結(jié)合酚對(duì)DPPH清除效率更強(qiáng)。楊希娟等[14]通過(guò)對(duì)不同粒色青稞中游離酚和結(jié)合酚的抗氧化活性進(jìn)行評(píng)價(jià)，發(fā)現(xiàn)酚類化合物對(duì)自由基清除具有選擇性，結(jié)合酚對(duì)DPPH可能具備更好的清除效果。

a-游離酚;b-結(jié)合酚圖2 DPPH自由基清除能力Fig.2 Scavenging activity of DPPH free radicals

2.3 ABTS自由基清除能力

由圖3可知，樣品中游離酚和結(jié)合酚對(duì)ABTS具有清除效果，隨樣品量增大ABTS清除率增強(qiáng)。清除ABTS強(qiáng)弱順序?yàn)樗{(lán)色小麥、紫色小麥、普通小麥。

a-游離酚;b-結(jié)合酚圖3 ABTS自由基清除能力Fig.3 Scavenging activity of ABTS free radicals

當(dāng)小麥質(zhì)量濃度在40 mg/mL時(shí)，游離酚ABTS清除率依次為：(55.2±2.4)%、(51.5±2.3)%、(43.8±1.9)%，藍(lán)色小麥和紫色小麥的IC50值分別為：36.3、40.1 mg/mL；結(jié)合酚對(duì)ABTS清除率依次為：(30.3±2.5)%、(29.1±2.6)%、(30.2±2.3)%。3組樣品中游離酚對(duì)ABTS的清除效果強(qiáng)于結(jié)合酚。

2.4 超氧陰離子清除能力

超氧陰離子參與機(jī)體中生物大分子的氧化損傷反應(yīng)，過(guò)多的超氧陰離子產(chǎn)生強(qiáng)氧化性，易引起機(jī)體損傷造成慢性疾病[25-26]。由圖4可知，樣品中游離酚和結(jié)合酚對(duì)超氧陰離子均有清除作用，隨樣品量增大超氧陰離子清除能力增強(qiáng)。清除超氧陰離子強(qiáng)弱順序?yàn)樗{(lán)色小麥、紫色小麥、普通小麥。當(dāng)小麥質(zhì)量濃度在40 mg/mL時(shí)，藍(lán)色小麥、紫色小麥及普通小麥游離酚超氧陰離子清除率依次為：(40.3±1.9)%、(32.0±2.1)%、(23.0±1.7)%；結(jié)合酚清除率依次為：(57.3±2.5)%、(53.1±2.6)%、(50.3±2.2)%，IC50值依次為：30.7、35.8、38.8 mg/mL。3組樣品中的結(jié)合酚對(duì)超氧陰離子表現(xiàn)更強(qiáng)的清除作用。

a-游離酚;b-結(jié)合酚圖4 超氧陰離子清除能力Fig.4 Scavenging activity of superoxide free radicals

2.5 羥自由基清除能力

羥自由基的電子能力強(qiáng)，過(guò)量的羥自由基會(huì)促進(jìn)細(xì)胞氧化，會(huì)誘導(dǎo)細(xì)胞毒性產(chǎn)生致癌作用。減少此類自由基可預(yù)防心血管疾病。研究發(fā)現(xiàn)，植物酚類的多羥基具有供電子能力，能夠清除羥自由基或阻斷Fenten反應(yīng)，減少羥自由基的產(chǎn)生量[27]。如圖5所示，樣品中游離酚和結(jié)合酚對(duì)羥自由基均有清除作用，隨樣品量增大其清除能力增強(qiáng)。清除羥自由基強(qiáng)弱順序?yàn)樗{(lán)色小麥、紫色小麥、普通小麥。當(dāng)小麥質(zhì)量濃度在40 mg/mL時(shí)，藍(lán)色小麥、紫色小麥及普通小麥的游離酚羥自由基清除率依次為：(51.1±2.1)%、(44.0±2.4)%、(38.2±1.8)%，藍(lán)色小麥IC50值為41.8 mg/mL；結(jié)合酚的羥自由基清除率依次為：(88.5±1.8)%、(82.1±1.7)%、(80.0±1.5)%，其IC50值依次為：9.9、12.7、14.5 mg/mL。3組樣品結(jié)合酚的IC50值均低于游離酚，說(shuō)明結(jié)合酚對(duì)羥自由基的清除效率高于游離酚。以上結(jié)果與Min等[31]的研究結(jié)論一致。

a-游離酚;b-結(jié)合酚圖5 羥自由基清除能力Fig.5 Scavenging activity of hydroxy free radicals

2.6 總還原力清除能力

研究發(fā)現(xiàn)還原能力與抗氧化能力密切相關(guān)，還原能力可作為抗氧化評(píng)價(jià)指標(biāo)。具有還原能力的物質(zhì)利用氫質(zhì)子將體系中鐵離子還原，從而起到抑制自由基產(chǎn)生，而酚類具有提供氫質(zhì)子的能力[28]。如圖6所示，樣品均表現(xiàn)出一定的還原能力，在700 nm下隨樣品量增大吸光度逐漸上升。清除總還原力強(qiáng)弱順序?yàn)樗{(lán)色小麥、紫色小麥、普通小麥。當(dāng)小麥質(zhì)量濃度在40 mg/mL時(shí)，藍(lán)色小麥、紫色小麥及普通小麥游離酚的總還原力依次為：(0.200±0.003)、(0.149±0.004)、(0.143±0.003)；結(jié)合酚的還原力依次為(0.188±0.003)、(0.186±0.002)、(0.181±0.003)。3組樣品結(jié)合酚和游離酚的還原效果接近，說(shuō)明游離酚和結(jié)合酚的還原能力差異不明顯，與NAYAK等[5]的研究結(jié)論較一致。

a-游離酚;b-結(jié)合酚圖6 總還原能力Fig.6 Reducing power

3 結(jié)論

本研究對(duì)藍(lán)色和紫色小麥中的游離酚及結(jié)合酚進(jìn)行提取并評(píng)價(jià)其抗氧化能力。研究發(fā)現(xiàn)藍(lán)色和紫色小麥中酚類含量豐富，樣品中結(jié)合酚含量高于游離酚，總酚含量表現(xiàn)為：藍(lán)色小麥>紫色小麥>普通小麥。體外抗氧化研究表明，樣品中游離酚和結(jié)合酚對(duì)DPPH自由基及ABTS自由基、超氧陰離子自由基、羥自由基、總還原力均具有較好的清除效果，酚含量與抗氧化效果呈正相關(guān)，但游離酚和結(jié)合酚對(duì)不同自由基清除效果存在差異?？寡趸芰φw表現(xiàn)為藍(lán)色小麥優(yōu)于紫色小麥優(yōu)于普通小麥。本試驗(yàn)可為彩色小麥作為保健食品開(kāi)發(fā)利用提供參考依據(jù)。