紅景天有效成分微生物發(fā)酵高值化轉化

吳捷，吳傳超，顧秋亞，余曉斌*

1(江南大學 生物工程學院，江蘇 無錫，214122) 2(工業(yè)生物技術教育部重點實驗室(江南大學)，江蘇 無錫，214122)

紅景天是在高海拔地區(qū)發(fā)現(xiàn)的景天科珍稀植物[1]，紅景天苷(salidroside, SAL)和酪醇(tyrosol, TYR)是所有紅景天屬植物的主要生物活性成分[2]。由于其具有抗氧化[3]、抗疲勞[4]、抗衰老[5]和適應性[6]等藥理作用，被用作食品作物和民間醫(yī)藥。而酪醇和紅景天苷含量的高低和抗氧化能力強弱常被作為評價紅景天屬植物藥用價值的指標[7]。

隨著酪醇和紅景天苷在健康食品、化妝品和制藥工業(yè)中的需求增加，野生紅景天植物被過度開發(fā)[8-9]。然而，紅景天植物的人工栽培一直受到海拔要求的限制，且種植面積大，生產周期長，活性成分含量低[10-12]。近年來，組織和細胞培養(yǎng)以及化學合成方法已用于SAL和TYR的生產，但這些方法成本高，產量低，對環(huán)境污染嚴重[13-14]。中藥的發(fā)酵炮制過程實際上是一個生物轉化的過程，具有選擇性強，反應條件溫和，轉化效率高，副產物少，有效成分破壞少，毒副作用低，下游處理方便等特點[15-17]。

酪醇的合成途徑被認為起源于酪氨酸[18]。微生物轉化酪醇及紅景天苷靠的是多酶反應，其中酪氨酸脫羧酶作為連接反應中初生代謝與次生代謝之間重要酶類，影響反應的進展與速度[19-20]。

本文利用生物轉化的方法合成酪醇，并利用篩選出的菌株發(fā)酵紅景天，以提高其中的紅景天苷含量和抗氧化性。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株及培養(yǎng)基

菌株：酵母菌株、乳酸菌菌株，由江南大學實驗室保藏。培養(yǎng)基：YPD培養(yǎng)基、MRS培養(yǎng)基；氨基酸脫羧酶選擇培養(yǎng)基：蛋白胨5 g/L，酵母浸粉3 g/L，葡萄糖1 g/L，1.6%溴甲酚紫-乙醇溶液1 mL，L-酪氨酸5 g/L，pH 6.8。紅景天發(fā)酵培養(yǎng)基：紅景天粉末50 g/L，KH2PO44g/L，尿素4 g/L，(NH4)2SO43 g/L，MgSO40.25 g/L。

1.1.2 中藥及試劑

紅景天，無錫市同仁堂藥店；酪醇標準品(純度均為98%)、紅景天苷標準品，大連美侖生物技術公司；甲醇、乙腈為色譜純，其他常用化學試劑均為市售分析純。

1.2 菌株的篩選

1.2.1 菌種初篩

酪氨酸在酪氨酸脫羧酶的作用下會產生CO2，形成的堿性產物生物胺會使培養(yǎng)基的pH下降，從而使指示劑溴甲酚紫變成紫色[21]。且L-酪氨酸在選擇平板中脫羧形成溶于水的產物酪醇，而L-酪氨酸微溶于水，因此在平板上形成透明圈，可以根據(jù)透明圈的大小和顏色變化程度來判斷微生物轉化L-酪氨酸的能力。

1.2.2 復篩

將初篩所得到的菌株接種到50 mL種子液中，培養(yǎng)24 h后按5%(體積分數(shù))接種量接于加入酪氨酸的發(fā)酵培養(yǎng)基中，在30 ℃、180 r/min下培養(yǎng)72 h。設置空白對照，不接入菌但加入酪氨酸；將種子液接種到不加入酪氨酸的50 mL的發(fā)酵液中，得到菌種對照；發(fā)酵3 d后，在4 ℃、10 000 r/min下離心10 min，將上清液旋干后用甲醇沉淀其中的蛋白，離心去除沉淀后再用10 mL甲醇定容，過0.22 μm濾膜，得到待檢測的樣品。

1.3 轉化產物分析

1.3.1 HPLC檢測

酪醇標準曲線的繪制：準確稱取20 mg酪醇標準品溶于10 mL甲醇中，并依次稀釋到質量濃度為50、100、200、400、800 mg/mL。得到標準方程為Y=3.300 1x+3.792，相關系數(shù)R2= 0.997 6。色譜條件及設備：采用SBC-18色譜柱(4.6 mm×150 mm)，流動相：A 0.1%磷酸∶B甲醇∶C乙腈=75∶20∶5(V∶V∶V)，流速1 mL/min，檢測波長276 nm，溫度：30 ℃。

1.3.2 液質聯(lián)用分析

采用HPLC-ESI-MS測定化合物的相對分子量，根據(jù)圖譜上相對保留時間以及特征碎片離子推斷化合物的結構骨架及其斷裂方式。

質譜條件：離子方式：ESI-；離子源溫度100 ℃；脫溶劑溫度400 ℃；毛細管電壓3.5 kV；碰撞能量6 V；檢測器電壓1 800 V；選擇離子掃描范圍m/z在50～1 500。

1.4 發(fā)酵條件優(yōu)化

酵母菌以YPD為基本培養(yǎng)基，加入蔗糖、麥芽糖、乳糖、葡萄糖、可溶性淀粉等碳源，添加質量濃度分別為15、30、45、60、75 g/L；加入(NH4)2SO4、NH4Cl2、黃豆粉、玉米漿、胰蛋白胨、酵母粉等氮源，添加質量濃度分別為15、30、45、60、75 g/L，測定酪醇的產量，酪氨酸底物添加量為4 g/L。

1.5 應用

1.5.1 紅景天發(fā)酵

稱取紅景天2.5 g置于250 mL三角瓶中，加水50 mL，混勻，121 ℃滅菌20 min，即得中藥發(fā)酵培養(yǎng)基，將所篩選的菌株按接種量(體積分數(shù))10%接種到紅景天發(fā)酵培養(yǎng)基，酵母菌發(fā)酵體系于30 ℃、180 r/min發(fā)酵48 h，乳酸菌發(fā)酵中藥體系于37 ℃恒溫靜置培養(yǎng)48 h。

1.5.2 總還原力測定

參照AGRAWAL等[22]的方法，略有改動。吸取0.5 mL待測樣液，向其中加入0.5 mL 1%鐵氰化鉀溶液及0.5 mL PBS，混勻并置于50 ℃水浴恒溫反應20 min，取出放入冰浴中迅速冷卻，再加入0.5 mL 10%三氯乙酸溶液，混勻后離心。取上清液1.0 mL，加入1.0 mL水，再加入1.0 mL 0.1% FeCl3溶液，混勻，室溫靜置10 min后在700 nm處測定其吸光值，吸光值與待測樣品的總還原力呈正相關。

1.5.3 DPPH自由基清除能力測定

參照WANG等[23]方法并加以改進。吸取1.0 mL乙醇溶液，加0.5 mL DPPH自由基乙醇溶液(0.1 mmol/L)，加1.0 mL樣品溶液，混勻，在室溫下避光放置60 min，然后在517 nm下測定吸光度，并計算DPPH自由基清除率[14]。

(1)

式中：A0, 溶劑空白管吸光值；Ai,樣品管吸光值。

2 結果與分析

2.1 平板初篩

從198株菌株中篩選出80株能使平板變色，并具有菌落透明圈的菌株。其中酵母63株，乳酸菌17株。根據(jù)平板變色的時間和深淺初步判斷微生物產酪氨酸脫羧酶的能力強弱。試驗僅觀察平板點種2 d后的平板顏色變化，篩選結果如圖1。其中圖1-A不能使平板變色，圖1-B和圖1-C都能使平板變色，圖1-C中的菌種長勢旺盛，變色范圍較1-B圖中菌株大。培養(yǎng)2 d后，C圖菌株已經能使整個平板變色。初步判斷其轉化能力較強。

A-不能使平板變色菌株；B-變色圈小菌株(Y1)；C-變色圈大的菌株(ww0304) 圖1 平板篩選轉化酪氨酸菌株Fig.1 Screen screening of transformed tyrosine strains

2.2 HPLC檢測

通過高效液相色譜對上述80株菌株是否能夠轉化成酪醇進行檢測分析，其中能夠轉化成酪醇的有9株，2株為酵母，7株為乳酸菌。并確定了1株轉化率最高的菌株WW0304。如圖2所示，紅景天苷標準品在3.304 min出峰，酪醇保留時間在4.895 min，其中圖2-B為空白對照組，即不接入菌種只加入底物酪氨酸，且在4.895 min未檢測到吸收峰，而發(fā)酵液圖2-C和圖2-D均在4.895 min處檢測到吸收峰，其中圖2-D為菌株WW0304發(fā)酵液圖譜。初步判斷該菌能夠將底物轉化成酪醇和紅景天苷。

A-紅景天苷標準品；B-空白對照；C-菌株Y1的發(fā)酵液；D-ww0304發(fā)酵液；E-酪醇標準品圖2 HPLC對產物的初步鑒定Fig.2 Preliminary identification of the product by HPLC

2.3 液質聯(lián)用檢測結果

對預處理后的發(fā)酵液進行進一步的液質分析，圖3為發(fā)酵液預處理后在保留時間4.616 min下的一級質譜圖。在m/z為137下的離子峰為[M-H]-,m/z為93下的離子峰猜測為離子碎片，為[M-H-COOH]-。

圖3 酪醇樣品一級質譜圖Fig.3 First-order mass spectrum of tyrosol sample

圖4為保留時間4.613 min下的二級質譜圖。在能量加大的情況下，物質斷裂的更加徹底，137的峰大量斷裂。而酪醇上的苯環(huán)不易斷裂，因此未有新的離子峰出現(xiàn)。

圖4 酪醇樣品二級質譜圖Fig.4 Secondary spectrum of tyrosol sample

2.4 發(fā)酵條件優(yōu)化

2.4.1 碳源對酪醇產量的影響

碳源對酪醇產量的影響結果如圖5所示。當乳糖、淀粉為碳源時，微生物基本不生成酪醇，而當葡萄糖為碳源時，酪醇的產量最高。其原因可能是葡萄糖會促進菌株產酪氨酸脫羧酶，并且對于菌株合成酪醇來說是必不可少的[24]。其中添加質量濃度為20 g/L的葡萄糖，可促使該菌株產酶活性和酪醇的產量最大，為2.3 g/L。

A-不同碳源對酪醇含量的影響；B-葡萄糖質量濃度對酪醇含量的影響圖5 碳源對酪醇產量的影響Fig.5 Effect of carbon sources on tyrosol production

2.4.2 氮源對酪醇產量的影響

氮源對酪醇產量的影響結果如圖6所示。有機氮源對酪醇的產量有促進作用，當添加質量濃度為30 g/L的玉米漿時，酪醇的產量最高，為2.3 g/L。玉米漿能促進產酶和提高產量，可能是因為其含有大量的維生素和其他微量元素。

A-不同氮源對酪醇含量的影響；B-玉米漿濃度對酪醇含量的影響圖6 氮源對酪醇產量的影響Fig.6 Effect of nitrogen source on tyrosol production

2.5 在紅景天發(fā)酵中的應用

將9株能夠轉化酪氨酸的菌株接種到紅景天培養(yǎng)基中進行發(fā)酵，通過高效液相色譜(圖7-A)對其中TRY和SAL進行定量分析。發(fā)酵后酪醇和紅景天苷含量都得到提高，其中菌株WW0304(圖7-B菌株Y2)發(fā)酵后總有效成分提高最多，酪醇產量提高235%，紅景天苷產量提高了109.9%左右。

A-發(fā)酵液前后液相對比圖；B-不同菌種發(fā)酵有效成分含量對比圖7 不同菌種發(fā)酵液中酪醇和紅景天苷含量對比Fig.7 Comparison of tyrosol and salidroside in fermentation broth of different strains

以維生素C(Vc)作為陽性對照，對紅景天水提液及WW0304紅景天發(fā)酵液的總還原力進行研究(圖8)。在不同的質量濃度范圍內，紅景天發(fā)酵液總還原力均明顯高于水提液的總還原力。在10.5～52.5 mg/L范圍內，相同質量濃度紅景天發(fā)酵液的總還原力大于Vc溶液的總還原力。

圖8 紅景天水提液及發(fā)酵液還原力對比Fig.8 Comparison of total reducing power before and after fermentation of Rhodiola

紅景天發(fā)酵前后的DPPH自由基清除率如圖9所示。紅景天發(fā)酵后其清除DPPH自由基能力增強，抗氧化能力增加。在0.42～1.47 g/L，紅景天發(fā)酵液的DPPH自由基清除率高于水提液，空白發(fā)酵液的DPPH自由基清除能力較差。當質量濃度為0.42 g/L時，發(fā)酵液的DPPH自由基清除率為7.98%，而當質量濃度為168 g/L時，紅景天發(fā)酵液的清除率達到61.01%，在0.42～1.47 g/L隨著紅景天濃度的增高，DPPH自由基清除能力增強。

圖9 紅景天發(fā)酵前后DPPH自由基清除率對比Fig.9 Comparison of DPPH clearance rate before and after fermentation of Rhodiola

3 結論

酪氨酸和紅景天苷的微生物轉化基于多酶反應，其中酪氨酸脫羧酶在連接反應中作為初級代謝和次級代謝之間的重要酶，影響反應的速度和進程。通過含溴甲酚紫的平板顯色試驗，篩選出能轉化酪氨酸的菌株，并通過搖瓶復篩判定其轉化能力。實驗確定1株轉化率較高的菌株WW0304，以葡萄糖為碳源，玉米粉為氮源，且葡萄糖添加的質量濃度為20 g/L，玉米漿質量濃度為30 g/L時，酪醇產量達到2.3 g/L。最終將篩選到的菌株應用于紅景天發(fā)酵，酪醇產量由發(fā)酵前的0.23 g/L增加為0.78 g/L，提高了235%，紅景天苷產量由發(fā)酵前的0.21 g/L增加到0.43g/L，提高了109.9%。發(fā)酵后的總還原力是發(fā)酵前的1.7倍，DPPH自由基清除能力由發(fā)酵前的35.45%增加到61.01%。本實驗為酪醇的生物合成提供了一種新的思路，并為紅景天的開發(fā)利用提供了新的方向。