BMP-4表達(dá)通過(guò)miRNA-21促進(jìn)腎細(xì)胞侵襲的機(jī)制研究

鐘 瑜，朱蕓蕓，韓文倫

(浙江省立同德醫(yī)院，浙江 杭州310013)

慢性腎臟病(CKD)是威脅世界公共健康的主要疾病之一[1]。研究發(fā)現(xiàn)腎小管間質(zhì)纖維化是導(dǎo)致腎功能衰竭的關(guān)鍵因素[1]。學(xué)者發(fā)現(xiàn)構(gòu)建抗腎間質(zhì)纖維化的蛋白質(zhì)，能增加其表達(dá)調(diào)控腎間質(zhì)纖維化機(jī)制[2]。本研究針對(duì)BMP-4表達(dá)通過(guò)miRNA-21促進(jìn)腎細(xì)胞侵襲的機(jī)制研究。

一、材料與研究方法

1.一般資料。選擇2005年1月至2017年12月我院腎內(nèi)科接診的90例腎纖維化患者石蠟切片，所有病例均經(jīng)病理學(xué)證實(shí)，本研究患者知情并同意，且我院倫理委員會(huì)審批通過(guò)。

2.方法。(1)原代培養(yǎng)： 所選研究腎病纖維化患者邊緣組織，在消毒液中標(biāo)本進(jìn)行初步處理，原代培養(yǎng)。采用酶消化法進(jìn)行元代培養(yǎng)，將組織剪成1mm2碎塊置于標(biāo)本消化液中，后移至容量為50mL的無(wú)菌管中，加入消化液值15mL，于恒溫?fù)u床中反應(yīng)2h。離心機(jī)離心，取上清液。(2)CAFs與腎纖維化細(xì)胞共培養(yǎng)： Trans-well模型，上室加入1×105個(gè)腎纖維化細(xì)胞(NRK-52E)，下室加入2×105個(gè)CAFs和預(yù)先轉(zhuǎn)染MBP-4 siRNA的CAFs,37℃恒溫下培養(yǎng)48h后收集共培養(yǎng)的腎纖維化細(xì)胞。(3)siRNA轉(zhuǎn)染： 使用無(wú)血清培養(yǎng)基稀釋BMP-4、siRNA-21、miRNA-21，稀釋后與轉(zhuǎn)染劑混合，室溫孵育20分鐘。(4)抑制BMP-4/封閉miRNA-21表達(dá)： 6孔板鋪2×105個(gè)CAFs腎纖維化細(xì)胞，在溫度-37℃下培養(yǎng)24h后，棄上清液，加入無(wú)血清培養(yǎng)基(2ml)，每孔中滴入混合物培養(yǎng)24h后收集細(xì)胞。(5)高表達(dá)BMP-4的CAFs對(duì)腫瘤細(xì)胞遷移能力和侵襲能力實(shí)驗(yàn)。①細(xì)胞遷移能力實(shí)驗(yàn)： 所用模型為Trans-well模型。收集處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的CAFs，先轉(zhuǎn)染BMP-4的CAFs及NRK-52E細(xì)胞。調(diào)整細(xì)胞濃度至合適值，培養(yǎng)24h后將取下，用乙醇預(yù)冷固定后，進(jìn)行HE染色。置于顯微鏡下觀察，并分析腎纖維細(xì)胞的轉(zhuǎn)移能力改變情況。②細(xì)胞侵襲能力實(shí)驗(yàn)： 其他步驟同上上述遷移能力實(shí)驗(yàn)。不同之處為培養(yǎng)時(shí)間為48h。(6)BMP-4誘導(dǎo)的侵襲和遷移能力，miRNA-21的作用影響實(shí)驗(yàn)。①侵襲能力影響實(shí)驗(yàn) ： 用無(wú)血清培養(yǎng)基提前調(diào)整好的預(yù)先轉(zhuǎn)染BMP-4腎纖維細(xì)胞NRK-52E濃度后，加入到Trans-well模型上室。方法同上。②遷移能力影響實(shí)驗(yàn)： 方法同上。(7)IHC實(shí)驗(yàn)： 用0.01mol/L的枸緣酸鹽修復(fù)液高壓修片3分鐘，然后滴加anti-BMP4和anti-miRNA-21，24小時(shí)后。用PBS洗滌三次后滴加二抗，室溫下靜置20分鐘，再用PBS洗滌三次，最后進(jìn)行顯色，復(fù)染，脫水封片等操作。掃描儀掃描，留存。

3.觀察指標(biāo)。BMP-4和miRNA-21免疫組化實(shí)驗(yàn)染色結(jié)果判定標(biāo)準(zhǔn)： 陽(yáng)性細(xì)胞評(píng)分×染色強(qiáng)度評(píng)分。0分無(wú)表達(dá)，1-3分可以表達(dá)，4-6分弱表達(dá)，7-12分強(qiáng)表達(dá)。

二、結(jié) 果

1.BMP-4高表達(dá)的KAFs對(duì)腎細(xì)胞遷移能力和侵襲能力的影響。腎細(xì)胞的遷移和侵襲能力在KAFs共培養(yǎng)后顯著增強(qiáng)，BMP-4的表達(dá)受到siRNA抑制后，KAFs對(duì)遷移能力和侵襲能力的促進(jìn)作用得到有效抑制(見(jiàn)圖1、圖2)。

2.BMP-4和miRNA-21免疫組化染色結(jié)果。BMP-4主要在腎間質(zhì)成纖維細(xì)胞核中表達(dá)，miRNA-21主要在腎纖維細(xì)胞膜中表達(dá)。90例患者臨床資料、BMP-4和miRNA-21與病理學(xué)參數(shù)的關(guān)系： BMP-4和miRNA-21在腎纖維細(xì)胞中的陽(yáng)性率分別為56.67%(51/90)和43.33%

圖1 KAFs共同培養(yǎng)后腎纖維細(xì)胞遷移的能力

圖2 KAFs共同培養(yǎng)后腎纖維細(xì)胞侵襲的能力

(39/90)，并且其表達(dá)與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移、TNM分期差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

三、討 論

研究發(fā)現(xiàn)TGF-β信號(hào)系統(tǒng)可通過(guò)將其特異的SMAD轉(zhuǎn)導(dǎo)蛋白添加到pri-miR-21的復(fù)合物上，從而增強(qiáng)miRNA-21的表達(dá)[3]。本項(xiàng)目研究，利用miRNA-21提前封閉腎細(xì)胞中siRNA的表達(dá)，當(dāng)其表達(dá)受到阻斷后，明顯限制了BMP-4的促腎細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移作用。免疫組化表明，經(jīng)KAFs共培養(yǎng)后腎細(xì)胞遷移能力和侵襲能力顯著增強(qiáng)，利用siRNA抑制BMP-4的表達(dá)后，KAFs抑制遷移和侵襲能力的效果得到抑制。在腎細(xì)胞中BMP-4和miRNA-21陽(yáng)性率分別為56.67%(51/90)和43.33%(39/90)，BMP-4和miRNA-21表達(dá)與遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移、TNM、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有較大關(guān)系。

綜上，在KAFs中BMP-4表達(dá)通過(guò)miRNA-21促進(jìn)提高腎細(xì)胞侵襲遷移能力，為今后腎病的治療和預(yù)后提供參考依據(jù)。