骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞來(lái)源的外泌體對(duì)骨再生機(jī)制研究

何偉 陳榮春 曾芳俊 曾文叢

贛州市人民醫(yī)院, 江西 贛州 341000

骨再生一直是骨科領(lǐng)域研究的熱點(diǎn)問(wèn)題，有效的骨再生治療依然存在巨大臨床需求。隨著組織工程研究的逐漸深入，間充質(zhì)干細(xì)胞在組織再生中的重要性得到了越來(lái)越多的關(guān)注。骨髓來(lái)源的間充質(zhì)干細(xì)胞(bone marrow mesenchymal stem cells，BMSCs)因其獲取方法方便而較為常用。 BMSC具有修復(fù)骨組織損傷的能力[1-2]。BMSCs的上清液同樣有修復(fù)受損組織的功能，其作用可能與干細(xì)胞通過(guò)旁分泌囊泡調(diào)節(jié)靶細(xì)胞功能有關(guān)[3-4]。外泌體(Exosome)作為干細(xì)胞旁分泌成分之一，在干細(xì)胞調(diào)節(jié)靶細(xì)胞功能中起到了十分重要的作用。外泌體一般直徑為40～160 nm，其內(nèi)包含來(lái)源細(xì)胞內(nèi)合成的mRNA、miRNA、酶等成分[5-8]，通過(guò)出芽的方式進(jìn)入細(xì)胞外基質(zhì)，被靶細(xì)胞內(nèi)吞后釋放內(nèi)部成分，完成細(xì)胞間的通訊和信息交流[9-11]。外泌體可以有效修復(fù)受損的組織、器官[12-15](如心、肺、腎、腦等)，說(shuō)明移植外泌體可以發(fā)揮移植干細(xì)胞類似的作用。因此假設(shè)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞來(lái)源的外泌體(BMSC-Exos)能表現(xiàn)出與BMSC相似的生物學(xué)功能，即促進(jìn)骨再生。本研究將驗(yàn)證BMSC-Exos對(duì)骨再生的作用，初步探索其骨再生的機(jī)制，希望能為將來(lái)外泌體治療骨再生提供理論依據(jù)，同時(shí)為臨床探索骨再生問(wèn)題提供新的線索和思路。

1 材料與方法

1.1 材料

人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞取自外傷病人的股骨骨髓(經(jīng)知情同意后)，大鼠成骨細(xì)胞取自乳鼠(SD大鼠)顱骨。DMEM/F-12培養(yǎng)基、IMDM培養(yǎng)基購(gòu)自美國(guó)Gibco公司，F(xiàn)BS購(gòu)自美國(guó)hyclone公司，外泌體分離試劑盒購(gòu)自美國(guó)Invitrogen公司，用于流式細(xì)胞檢測(cè)的單克隆抗體購(gòu)自美國(guó)Pharmingen公司，成骨誘導(dǎo)培養(yǎng)基和成脂誘導(dǎo)培養(yǎng)基的各組分購(gòu)自美國(guó)Sigma公司。

1.2 方法

1.2.1 BMSC培養(yǎng)：采集骨髓血置于15 mL離心管中，加入等量PBS，1 500 r/min 離心20 min，棄去脂肪層，重復(fù)兩次。取Ficoll分離液5 mL(1.077 g/mL)加入新的離心管中，將上述稀釋后的骨髓液緩慢沿著管壁加至Ficoll分離液上層。室溫下2 500 r/min離心20 min。吸取離心管中白色細(xì)胞層至另一離心管中，此層細(xì)胞包含了BMSC、造血干細(xì)胞等，加適量PBS重懸并沖洗，1 500 r/min離心15 min，重復(fù)兩次。用DMEM/F-12完全培養(yǎng)基重懸細(xì)胞沉淀，接種至T25培養(yǎng)瓶中，CO2恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)72 h后第一次換液，此時(shí)BMSC已貼壁生長(zhǎng)，后每3天換液一次。原代細(xì)胞培養(yǎng)14 d左右可傳代，傳代細(xì)胞培養(yǎng)6 d左右可再次傳代。

1.2.2 BMSC表面抗原和多系分化能力鑒定：①取P4～P6代BMSC細(xì)胞，通過(guò)流式細(xì)胞儀檢測(cè)BMSC表達(dá)CD29、CD44、CD90、CD34、CD45的情況; ②進(jìn)行成脂誘導(dǎo)培養(yǎng)。在6孔板中接種BMSC，加入脂肪分化誘導(dǎo)培養(yǎng)基，每3天更換培養(yǎng)液，誘導(dǎo)3周后進(jìn)行油紅O染色鑒定; ③進(jìn)行成骨誘導(dǎo)培養(yǎng)。在6孔板中接種BMSC，加入成骨分化誘導(dǎo)培養(yǎng)基，每3天更換培養(yǎng)液，誘導(dǎo)3周后進(jìn)行茜素紅染色鑒定。

1.2.3 BMSC-Exos提取與鑒定:通過(guò)invitrogen試劑盒提取BMSC-Exos。BMSCs培養(yǎng)至P4～P6代，每次為細(xì)胞換液時(shí)注意收集培養(yǎng)上清，暫時(shí)保存在4 ℃中。吸取培養(yǎng)上清至高速離心管中，在4 ℃以2 000g離心30 min，以去除雜質(zhì)。轉(zhuǎn)移上清液至新的離心管中，按照上清液：試劑=2∶1的比例加入試劑，在渦旋振蕩器上充分混勻后在4 ℃冰箱孵育12 h。取出離心管，在4 ℃以10 000g離心60 min，棄去上清液，小心用PBS重懸離心沉淀即為BMSC-Exos懸液，將其置于-20 ℃保存。通過(guò)透射電鏡(TEM)和免疫電泳(Western Blot)觀察BMSC-Exos的形態(tài)和抗原表達(dá)。

1.2.4 體外驗(yàn)證BMSC-Exos骨分化能力:參照文獻(xiàn)方法[16]培養(yǎng)原代成骨細(xì)胞。無(wú)菌條件下取出出生24 h內(nèi)乳鼠(SD大鼠)的顱蓋骨，放入盛有PBS溶液(內(nèi)含1%雙抗)的培養(yǎng)皿中，并刮去表面結(jié)締組織(如骨膜、血管)。剪碎骨片成1 mm大小，用2.5 g/L的胰蛋白酶37 ℃消化20 min，PBS沖洗后棄去上清。再用1.0 g/L的II型膠原酶消化2次，每次1 h。吸取上清液加入至DMEM培養(yǎng)基(內(nèi)含10% FBS，1%雙抗)中，置于二氧化碳恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)，每3天換液一次。收集P4～P5代成骨細(xì)胞，接種至6孔板上，加入DMEM培養(yǎng)基。每3天換液一次，每次換液除了加入2 mL DMEM外，按照如下分組加入BMSC-Exos懸液：①Exo懸液(50 μL)；②Exo懸液(20 μL)+PBS(30 μL)；③PBS(50 μL)。以上3組細(xì)胞培養(yǎng)12 d后，一部分細(xì)胞行茜素紅和堿性磷酸酶(ALP)染色，一部分細(xì)胞行分子生物學(xué)檢測(cè)。

1.2.5 BMSC-Exos對(duì)骨再生機(jī)制的探索:取上述經(jīng)過(guò)BMSC-Exos處理12 d后的3組成骨細(xì)胞。一部分用于提取蛋白，行Western Blot檢測(cè)。用RIPA細(xì)胞裂解液裂解細(xì)胞，獲得細(xì)胞內(nèi)總蛋白，通過(guò)免疫電泳檢測(cè)成骨細(xì)胞中OCN、Runx2、β-catenin蛋白含量，并比較組間差異。另一部分細(xì)胞用于提取RNA，行qRT-PCR檢測(cè)。用RNA提取試劑盒提取細(xì)胞內(nèi)的總RNA，通過(guò)qRT-PCR定量檢測(cè)Runx2基因表達(dá)量，并比較組間差異。

圖2 BMSC分別經(jīng)成骨誘導(dǎo)培養(yǎng)和成脂誘導(dǎo)培養(yǎng)后，茜素紅染色(左)和油紅O染色(右)均呈陽(yáng)性(×100倍)Fig.2 BMSCs were positive for alizarin red staining (left) and oil red O staining (right) after osteogenic induction and adipogenic induction culture, respectively (×100 times)

1.2.6 體外驗(yàn)證BMSC-Exos 促進(jìn)細(xì)胞增殖能力：取P4～P5代成骨細(xì)胞接種于96孔板上，通過(guò)CCK-8細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)檢測(cè)BMSC-Exos對(duì)成骨細(xì)胞增殖能力的影響。按照每天加入培養(yǎng)基的不同分為以下3組：①Exo懸液50 μL + DMEM培養(yǎng)基50 μL；②Exo懸液20 μL + DMEM培養(yǎng)基80 μL；③Exo懸液0 μL+ DMEM培養(yǎng)基100 μL。每組設(shè)置5個(gè)復(fù)孔，每孔加入10 μL CCK-8檢測(cè)液后37 ℃孵育2.5 h，放于酶標(biāo)儀上測(cè)450 nm處的吸光度(OD 450)。連續(xù)測(cè)定一周，繪制成骨細(xì)胞生長(zhǎng)曲線。

1.2.7 體內(nèi)驗(yàn)證BMSC-Exos修復(fù)大鼠顱骨缺損能力:取3月齡SD大鼠16只，實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組各8只。4%水合氯醛腹腔麻醉，麻醉后備皮、消毒、無(wú)菌手術(shù)，在大鼠頭部正中做2.5 cm切口，逐層分離至顱骨正中線，分離骨膜。用磨鉆于雙側(cè)頂骨各做直徑5 mm的全層顱骨缺損，注意不可鉆過(guò)深以避免傷及顱內(nèi)組織。實(shí)驗(yàn)組在顱骨缺損處注射100 μBMSC-Exos懸液，對(duì)照組顱骨缺損處注射100 μL PBS緩沖液。術(shù)畢縫合，肌肉注射青霉素預(yù)防感染，放置在動(dòng)物房中統(tǒng)一飼養(yǎng)。術(shù)后8周，將大鼠過(guò)量麻醉致死，取出顱蓋骨，清理表面軟組織后，一部分標(biāo)本行micro-CT檢測(cè)，一部分標(biāo)本脫鈣后制作石蠟切片觀察。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)通過(guò)了贛州市人民醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

所有實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)通過(guò)3次以上獨(dú)立實(shí)驗(yàn)得出，以均值±標(biāo)準(zhǔn)差形式表示，組間差異比較通過(guò)方差分析和t檢驗(yàn)完成，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 BMSC培養(yǎng)與鑒定

原代提取的BMSC在鏡下呈長(zhǎng)梭形或多角形，貼壁生長(zhǎng)，細(xì)胞核大，形態(tài)均一。表面抗原高表達(dá)CD 29、CD 44、CD 90(×400倍)這些間充質(zhì)干細(xì)胞標(biāo)志物，低表達(dá)CD 34、CD 45等造血細(xì)胞標(biāo)志物，BMSC細(xì)胞形態(tài)見(jiàn)圖1。CD 29、CD 44、CD 90的BMSC百分比(%)分別為：97±0.43，98±0.22，98±0.78，未見(jiàn)CD 34、CD 45表達(dá)。經(jīng)過(guò)成骨誘導(dǎo)培養(yǎng)和成脂誘導(dǎo)培養(yǎng)后，茜素紅染色和油紅O染色均為陽(yáng)性(×100倍)，見(jiàn)圖2。以上結(jié)果表明分離培養(yǎng)所得的BMSC符合間充質(zhì)干細(xì)胞特征。

圖1 BMSC細(xì)胞形態(tài)及表面抗原表達(dá)情況Fig.1 BMSC cell morphology and surface antigen expression

2.2 BMSC-Exos鑒定

TEM下觀察外泌體呈兩面凹的橢圓形或圓形，直徑40～120 nm(81.7±19.9)，有完整的磷脂雙分子層膜結(jié)構(gòu)。Western Blot顯示BMSC-Exos表達(dá)源細(xì)胞表面蛋白CD 69、CD 81(×100)。

圖3 TEM下BMSC-Exos形態(tài)Fig.3 The morphology of BMSC-Exos in TEM

2.3 BMSC-Exos體外促成骨、促細(xì)胞增殖

成骨細(xì)胞培養(yǎng)12 d后，茜素紅染色和堿性磷酸酶(ALP)染色結(jié)果呈陽(yáng)性。茜素紅染色強(qiáng)度與成骨細(xì)胞內(nèi)鈣鹽沉積量呈正相關(guān)，ALP染色強(qiáng)度與成骨細(xì)胞內(nèi)ALP活性呈正相關(guān)。染色強(qiáng)度從強(qiáng)到弱依次為：Exos(50 μL)組，Exos(20 μL)組，PBS對(duì)照組。表明BMSC-Exos的存在可以促進(jìn)成骨細(xì)胞礦化過(guò)程(×100倍)。

圖4 茜素紅和ALP染色結(jié)果Fig.4 Alizarin red and ALP staining results

通過(guò)CCK-8細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)，驗(yàn)證BMSC-Exos對(duì)成骨細(xì)胞的增殖影響，結(jié)果可以看出加入BMSC-Exos后成骨細(xì)胞增殖速度明顯提高，且提高程度與加入BMSC-Exos的量呈正相關(guān)。結(jié)果提示BMSC-Exos對(duì)成骨細(xì)胞增殖有促進(jìn)作用。

2.4 BMSC-Exos體內(nèi)促進(jìn)骨再生

對(duì)術(shù)后8周的標(biāo)本行Micro-CT檢測(cè)，結(jié)果如6圖所示。加入BMSC-Exos的實(shí)驗(yàn)組(右)與空白對(duì)照組(左)相比，新生骨量更多，骨缺損修復(fù)程度更好。

圖5 CCK-8細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證BMSC-Exos對(duì)成骨細(xì)胞增殖的影響Fig.5 CCK-8 cell proliferation assay verified the effect of BMSC-Exos on osteoblast proliferation

圖6 Micro-CT檢測(cè)結(jié)果Fig.6 Micro-CT test results

對(duì)術(shù)后8周的顱骨標(biāo)本脫鈣后制作石蠟切片并行HE染色，結(jié)果顯示，加入BMSC-Exos的實(shí)驗(yàn)組(下)與對(duì)照組(上)相比，新生骨明顯增多(左×100倍，右×400倍)，骨缺損處成骨細(xì)胞、骨細(xì)胞更多，形成的編織骨組織更多、連接成片，有髓樣組織，骨小梁樣結(jié)構(gòu)更多。見(jiàn)圖7。

圖7 石蠟切片HE染色結(jié)果Fig.7 HE staining results of paraffin sections

2.5 BMSC-Exos促進(jìn)骨再生機(jī)制

通過(guò)Western Blot檢測(cè)成骨細(xì)胞中成骨相關(guān)蛋白OCN、Runx2的表達(dá)，結(jié)果顯示加入BMSC-Exos后，成骨細(xì)胞中OCN、Runx2蛋白表達(dá)含量明顯上升，且隨著B(niǎo)MSC-Exos量的增加而增加。同時(shí)，檢測(cè)了成骨過(guò)程重要調(diào)控通路Wnt/β-catenin通路中的關(guān)鍵蛋白β-catenin，結(jié)果顯示β-catenin蛋白含量也隨BMSC-Exos量的增加而增加。表明BMSC-Exos促進(jìn)骨再生過(guò)程可能與激活Wnt/β-catenin調(diào)控通路有關(guān)。

圖8 Western Blot結(jié)果Fig.8 Western Blot results

通過(guò)qRT-PCR方法對(duì)Runx2基因表達(dá)量定量分析如圖9所示，結(jié)果顯示BMSC-Exos上調(diào)了Runx2基因的表達(dá)，進(jìn)一步說(shuō)明BMSC-Exos促進(jìn)成骨的能力與上調(diào)成骨相關(guān)基因的表達(dá)有關(guān)。

圖9 qRT-PCR結(jié)果Fig.9 qRT-PCR results

3 討論

間充質(zhì)干細(xì)胞是一種能向多種細(xì)胞系分化同時(shí)自我更新能力強(qiáng)的干細(xì)胞，能在特定的條件下向多種組織細(xì)胞分化(如骨、軟骨、脂肪、神經(jīng)等)，可在全身多種組織(如骨髓、臍帶等)中分離而得，而骨髓來(lái)源的間充質(zhì)干細(xì)胞因其獲取方法方便而較為常用。大量研究者[1,17]將間充質(zhì)干細(xì)胞用于組織修復(fù)，無(wú)論應(yīng)用于動(dòng)物模型還是臨床治療都取得了很好的效果。然而，干細(xì)胞移植仍然無(wú)法避免移植效率低、致畸風(fēng)險(xiǎn)、倫理風(fēng)險(xiǎn)等諸多問(wèn)題。

干細(xì)胞發(fā)揮組織修復(fù)作用與旁分泌機(jī)制密切相關(guān)，外泌體(Exosomes)作為干細(xì)胞旁分泌成分中的重要組成部分，其內(nèi)含物包括核酸、蛋白質(zhì)、酶等，通過(guò)內(nèi)吞的方式進(jìn)入靶細(xì)胞內(nèi)發(fā)揮作用，可以代替干細(xì)胞發(fā)揮組織修復(fù)能力，如修復(fù)心、肺、腎、腦等[12-15]組織器官的損傷。同時(shí)由于外泌體的低免疫原性、無(wú)細(xì)胞活性等特點(diǎn)，也降低了干細(xì)胞移植的風(fēng)險(xiǎn)。

在細(xì)胞培養(yǎng)過(guò)程中，外泌體主要存在于細(xì)胞培養(yǎng)的上清液中。目前常用來(lái)富集濃縮外泌體的方法主要有超速離心法和試劑盒法，根據(jù)試劑盒廠家不同具體方法也不同。有研究[18]比較了兩種方法的差異，但業(yè)內(nèi)對(duì)于兩種方法的優(yōu)缺點(diǎn)尚無(wú)統(tǒng)一意見(jiàn)。本研究采用的是試劑盒法提純BMSC-Exos，通過(guò)透射電鏡觀察可見(jiàn)BMSC-Exos呈兩面凹的圓形或橢圓形，直徑約40～120 nm(81.7±19.9)，表面抗原符合來(lái)源細(xì)胞表達(dá)特征，這與前人研究結(jié)果相類似。

BMSCs在骨再生過(guò)程中發(fā)揮至關(guān)重要的作用，移植BMSCs可以促進(jìn)骨缺損部位的骨修復(fù)。那么移植BMSC-Exos是否可以達(dá)到與移植BMSC相類似的效果呢？本研究通過(guò)體內(nèi)體外實(shí)驗(yàn)予以了驗(yàn)證。首先，將BMSC-Exos加入成骨細(xì)胞培養(yǎng)基中，發(fā)現(xiàn)隨著B(niǎo)MSC-Exos量的增多，成骨細(xì)胞的茜素紅和ALP染色強(qiáng)度增加，表明成骨細(xì)胞內(nèi)鈣鹽沉積和酶活性提高，因此BMSC-Exos有促進(jìn)成骨作用。然后，將BMSC-Exos用于大鼠顱骨缺損模型，micro-CT和組織切片顯示，實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組相比新生骨量增多，BMSC-Exos在體內(nèi)也有促進(jìn)骨再生作用。最后對(duì)加入BMSC-Exos后的成骨細(xì)胞進(jìn)行了分子生物學(xué)分析，分析表明與成骨過(guò)程相關(guān)的蛋白OCN、Runx2均有明顯升高，成骨相關(guān)基因Runx2表達(dá)上調(diào)。成骨過(guò)程受到復(fù)雜的信號(hào)通路的調(diào)節(jié)，Wnt/β-catenin通路是其中一條重要的調(diào)節(jié)通路，β-catenin是這條通路中的關(guān)鍵蛋白。本研究測(cè)定了成骨細(xì)胞中β-catenin的含量，免疫電泳顯示BMSC-Exos處理后β-catenin含量升高并與BMSC-Exos濃度呈正相關(guān)，提示BMSC-Exos可能通過(guò)激活了Wnt/β-catenin通路而促進(jìn)成骨。具體的分子機(jī)制本研究尚未詳細(xì)討論，因此需要后續(xù)研究進(jìn)一步驗(yàn)證。

本研究通過(guò)體內(nèi)體外實(shí)驗(yàn)證明了移植BMSC-Exos同樣可以發(fā)揮促進(jìn)骨再生、修復(fù)骨缺損的作用。這也進(jìn)一步驗(yàn)證了移植干細(xì)胞外泌體可以達(dá)到與移植干細(xì)胞類似的效果。外泌體具有低免疫原性、低細(xì)胞活性等特點(diǎn)，相比移植干細(xì)胞更安全，同時(shí)也避免了倫理等問(wèn)題?；谕饷隗w的治療方法對(duì)于受損組織、器官的修復(fù)具有巨大潛能，希望本研究的結(jié)果能夠?yàn)橥饷隗w的應(yīng)用提供理論依據(jù)。