電子顯微技術應用于生物納米材料表征與測試的研究進展

施云峰，薛 巍

(1.暨南大學 生物醫(yī)學工程系，廣東 廣州 510632；2.暨南大學 分析測試中心，廣東 廣州 510632)

電子顯微技術(Electron microscopy，EM)是利用電子光學系統(tǒng)進行顯微成像與原位分析的技術。電子的德布羅意波長更短，因此使用電子束光源的顯微鏡具有更高的分辨率。另外，電子束與樣品作用能激發(fā)出特征X射線、陰極熒光、俄歇電子等有價值的信號，可應用于原位元素分析。自20世紀30年代誕生了第一臺電子顯微鏡開始，隨著技術的發(fā)展，電子顯微鏡的分辨能力由最初的50 nm顯著提升至亞納米的原子尺度(配備球差矯正器)[1]，附件功能也得到了極大拓展，如：可進行實驗并實現原位觀察的樣品傳送裝置[2]；用于元素組成與分布測試的波長色散譜儀(WDS)[3]、X射線能譜儀(EDS)[4]、俄歇電子能譜儀(AES)[5]、電子能量損失譜儀(EELS)[6]；用于晶體樣品的電子衍射與高分辨成像[7]；用于冷凍電鏡(Cryo-EM)低襯度成像的直接電子檢測成像系統(tǒng)等[8]。

現代EM的推廣與應用，極大地推進了科學進步。尤其在生物納米材料研究領域，電子顯微鏡更是重要的分析與表征工具，可應用于指導新穎納米結構的構建、揭示材料與細胞/組織相互作用并發(fā)揮功能的機制[9]。本文結合研究實例，重點介紹了適用于生物納米材料研究的電子顯微結構表征與原位分析測試方法。

1 生物納米材料的定義與分類

生物納米材料是指一類應用于醫(yī)學診斷與治療，人體組織與受損器官結構與功能重建、恢復與增強的功能性材料[10]。按物理化學屬性可分為金屬材料、無機非金屬材料、有機高分子材料及其復合材料等；按來源可分為天然材料與合成材料兩大類。其生物安全性與功能性顯著依賴于顯微結構特征[11-12]。

2 電子顯微鏡的分類及其應用特點

透射電子顯微鏡(Transmission electron microscope,TEM)與掃描電子顯微鏡(Scanning electron micro scope,SEM)是開展材料科學研究的兩大利器?；赥EM的顯微形貌分析、電子衍射與高分辨成像、元素分析可應用于表征納米晶體(如金屬及其氧化物[13]、氧化硅[14]等)、納米片層與納米管(如石墨烯[15]、黑磷[16]、碳納米管[4]等)、金屬-有機物骨架材料(MOFs)[17]、聚合物納米結構[18](膠束、微球、聚合物納米涂層等)以及生物質膜偽裝納米載體[19]等；配備表面分析附件的SEM，可應用于表征樣品的表面顯微結構，測算其孔隙率和粗糙度，評價表面處理、改性、吸附的效果。此外，電子顯微鏡也可在細胞或亞細胞結構水平表征細胞或組織對納米材料的識別、吞噬，以及材料進入胞漿后的轉運、藥物釋放與降解過程，用于精確評價生物安全性并驗證預設的治療效果[20]。

3 應對生物納米材料特殊性的電子顯微實驗方法

生物納米材料涵蓋面廣，理化性能復雜多樣，對樣品制備方法與表征測試條件也有不同的要求。特別針對有機高分子樣品(低電子襯度、束流敏感、表面不導電)、磁性樣品、介孔樣品、材料與細胞或組織復合的樣品，需對常規(guī)實驗方法進行優(yōu)化。

3.1 TEM表征有機高分子樣品

絕大多數有機高分子基生物納米材料具有低電子襯度、束流敏感、易受輻照損傷的特點，如蛋白顆粒、由兩親聚合物自組裝形成的膠束、脂質體等。常規(guī)應對策略有：①增加入射電子束的劑量(Dose rate)，這樣可增強成像襯度，但也會增加電子輻照損傷，破壞樣品結構；②使用重金屬染液(磷鎢酸、醋酸雙氧鈾、檸檬酸鉛等)增強樣品與背景的襯度差，缺點是會導致分辨率降低。如Chetanachan等[21]報道了脂質體的TEM樣品負染色技術(Negative staining)，通過優(yōu)化染色條件(2.5%醋酸雙氧鈾，30 s)，成功表征了雙層膜結構。③20世紀80年代出現了冷凍電子顯微鏡技術(Cryo-electron microscopy,Cryo-EM)。通過對分散有納米顆粒的懸浮液進行快速冷凍處理，并使用冷臺承載樣品保持低溫氛圍，進行TEM成像。Cryo-EM可使冷凍樣品的輻照損傷被有效控制，配合使用先進的直接電子檢測器可捕獲極低襯度的圖像信息。Bates等[22]采用冷凍電鏡斷層成像技術(Cryo-electron tomography,Cryo-ET)研究含有聚氧化乙烯(PEO)的崁段聚合物在水中自組裝形成膠束和囊泡的過程，并使用液態(tài)乙烷將樣品快速冷凍至玻璃態(tài)，在低束流(Low dose)模式下直接獲得了高襯度像。

3.2 SEM表征不導電樣品

由于“荷電效應”，表面絕緣的SEM樣品表征前需進行導電化處理。雖然使用高真空噴涂鉑(Pt)較離子濺射金(Au)對樣品極表面納米結構的遮蔽效果更小，但不可避免地會在高放大倍數下顯現出偽像。如何實現不導電生物納米材料的直接表征，是個亟待解決的技術難題。已報道方法有：①通過特殊的電子光學系統(tǒng)設計，降低電子束的著陸電壓，在不損失分辨率的前提下縮短電子束在樣品表面的注入深度，減少、減緩負電荷的累積。②通過對樣品表面吹氣中和荷電的方法(Focal gas injection-based charge compensation)，直接表征表面絕緣的樣品。如Ellisman等[23]報道了對樣品表面局部吹打氮氣中和荷電的方法，實現了對不導電樣品的直接表征。

3.3 磁性樣品的表征

磁性納米粒子(如四氧化三鐵(Fe3O4)等)是一類重要的生物納米材料，可應用于磁場介導的靶向釋放體系[24]、磁熱療[25]等。如何利用電子顯微鏡安全、精確地表征磁性納米材料，具有較強的挑戰(zhàn)性。由于傳統(tǒng)電鏡光路系統(tǒng)使用多級磁透鏡對電子束進行匯聚，在接近樣品的極靴位置會產生磁場泄漏，易吸附磁性納米顆粒，嚴重影響電鏡的分辨率與使用安全。應對方法包括：①對樣品進行消磁處理，缺點是可能會改變樣品顯微形貌。②通過裝備洛倫茲透鏡(遠離樣品的磁透鏡)代替物鏡的成像功能，TEM可直接觀察磁性樣品[26]。③ZEISS公司專利Gemini鏡筒設計，使用靜電透鏡和電磁透鏡復合的電子光學系統(tǒng)，能顯著減少極靴處的磁泄漏。④不具備升級儀器條件時，可通過對樣品制備過程進行優(yōu)化，如使用合頁銅網包夾TEM樣品，或者將SEM樣品深嵌入導電膠層，防止樣品飛濺。

3.4 生物納米材料的三維結構表征

由于成像原理的限制，傳統(tǒng)TEM只能利用非彈性散射電子成平面投影像。雖然通過傾轉樣品可獲得連續(xù)的投影襯度，但是受限于樣品漂移和低信噪比，三維重構質量不高。SEM二次電子(SE2)檢測器可獲得樣品近表面的三維結構信息，但受景深限制，對大跨度復雜的立體結構與被表面遮蔽的孔隙與鑲嵌結構的表征效果較差。因此，如何精確、高效地獲取生物納米材料的三維結構信息具有較強的研究價值。當前主流的解決方案包括：

①連續(xù)切片掃描電子顯微技術(Serial block-face scanning electron microscopy)：將切片減薄系統(tǒng)置于SEM樣品室內，對包埋固定的樣品進行厚度可控的表面犧牲處理；吹打保護氣消除荷電，可直接對新暴露面進行SEM表征；收集連續(xù)圖像信息，重構納米尺度的大容量三維結構[27-28]。該技術可為評價納米顆粒的生物相容性、示蹤納米載體在細胞內、組織間的傳遞與降解過程，提供更直觀、準確的信息。

②冷凍電鏡三維重構技術在近年來得到了飛速發(fā)展。2017年諾貝爾化學獎授予了對發(fā)展與推廣現代冷凍電鏡技術做出杰出貢獻的3位科學家，以表彰其革新冷凍制樣方法，開發(fā)并推廣低電子襯度樣品高清成像技術，創(chuàng)新軟件算法應用于三維重構。Cryo-EM單顆粒重構技術適合表征結構均一性好的蛋白質、病毒、DNA顆粒。該法結合了襯度傳遞函數的修正，樣品投影數據的篩選，二維投影數據的分類和降噪，三維模型的重構與優(yōu)化等步驟，能夠獲得近原子尺度的高分辨像。Cryo-ET通過傾轉樣品，獲得高質量的連續(xù)二維投影像，適用于表征結構均一性差的脂質體、聚合物粒子。Stewart[29]綜述了使用Cryo-EM和Cryo-ET表征蛋白質、DNA、脂質、聚合物納米顆粒的制樣方法與圖像處理流程。

圖1 平插式與斜插式能譜探頭的位置示意圖[30]Fig.1 Geometry of the annular and conventional SDD EDS[30]

3.5 低電壓、低束流模式下的能譜測試

基于TEM/SEM的能譜分析，可原位測試生物納米材料的元素組成與分布。但對于束流敏感的有機高分子樣品，必須降低束流和加速電壓，這樣會損失能譜計數率，降低測試的靈敏度和準確度。應對策略包括：①使用大面積的能譜探測器，可增加入射X光子的接收率、改善信噪比，但同時也成倍地增加了生產成本。②平插式能譜(如Bruker QUANTAX FlatQUAD)將環(huán)形探測器置于極靴與樣品間，較傳統(tǒng)斜插方式能獲得更大的接收立體角(Solid angle)。其優(yōu)點在于既使低束流或極低束流(<10 pA)模式下，仍能獲得高計數率和高能量分辨率，對于表面不平整的樣品還能消除“陰影效應”。Hodoroaba等[30]對比了平插方式與斜插方式在能譜探測器設置、信號接收效率方面的差異(圖1)。平插式能譜具有更優(yōu)的信噪比、空間分辨率，在低加速電壓下仍能獲得高計數率，可對束流敏感樣品進行更精準的化學分析。

3.6 細胞與組織超微結構的表征

生物納米材料的安全性與功能性評價，包括細胞實驗與動物實驗。電子顯微鏡可應用于表征亞細胞結構。保存活細胞與組織的結構、脫除水分是制樣過程的關鍵。常規(guī)化學固定、梯度脫水、樹脂包埋、超薄切片與染色的方法，具有操作便捷、適用面廣的優(yōu)點，但化學固定劑(如戊二醛、多聚甲醛等)會破壞樣品的生物活性，不利于開展后續(xù)生化實驗；樹脂經滲透過程，替代了部分組織和細胞內容物，發(fā)揮支撐增強作用的同時也一定程度上改變了超微結構。高壓冷凍、冷凍替代、冷凍超薄切技術，雖避免了化學試劑使用，可兼顧保存樣品的結構與生物活性，但對制樣設備與操作也提出了更高的要求。

4 展 望

憑借著技術革新，電子顯微鏡的分辨力極限不斷被刷新，使得在原子尺度進行顯微結構表征變成了可能；同時附件的功能也不斷得到拓展，發(fā)展出一系列高精度的原位分析測試技術。“看得更清”、“測得更準”的現代電子顯微技術，將對生物納米材料學科的發(fā)展做出更大貢獻。

未來電子顯微技術的發(fā)展方向將更多集中于：①高分辨、超大尺寸圖像的拼接與大容量三維結構的重構。可更直觀、準確地表征新穎的微納結構，及其與細胞/組織作用發(fā)揮功能的情況；②對動態(tài)實驗過程進行原位表征與測試。如將液體樣品封閉在對電子束透明的薄層中，研究蛋白、多肽、聚合物的自組裝過程；③與其他成像技術(激光共聚焦(LSCM)、原子力顯微鏡(AFM)等)的聯用。開發(fā)兼容的軟件與可拼接硬件系統(tǒng)，預計可實現活細胞/組織的精準定位、整合AFM的單分子尺度力學測量數據(彈性、硬度、黏度和表面電荷密度)，構建大信息容量的復合圖像。