冰葡果醋的功能成分及抗氧化、降血糖 和降膽固醇作用

李晶，薛霖莉，郝左亮，郝林*

(1.山西農(nóng)業(yè)大學(xué) 食品科學(xué)與工程學(xué)院，山西 晉中 030801；2.山西農(nóng)業(yè)大學(xué)信息學(xué)院 食品 與環(huán)境學(xué)院，山西 晉中 030800；3.山西鱻淼酒莊有限公司，山西 晉中 030600)

冰葡萄是指將葡萄推遲采收，當(dāng)氣溫低于-7 ℃使葡萄在枝上保持一段時(shí)間，在結(jié)冰狀態(tài)下采收[1]，壓榨葡萄汁作為釀制冰葡萄酒的原料，此酒被譽(yù)為葡萄酒中的極品。產(chǎn)生的冰葡萄皮渣中仍含有較多黃酮類和多酚類等功能性成分。釀制葡萄酒產(chǎn)生的皮渣約占加工總量的20%～30%[2]，其中包含約33%的果皮、65%的種子及少量的果梗。將冰葡萄皮渣釀造為冰葡果醋可以充分利用皮渣中的功能成分，也可以賦予冰葡果醋冰葡萄特有的香氣，同時(shí)避免了資源的浪費(fèi)。目前，國(guó)內(nèi)外對(duì)冰葡萄皮渣的開(kāi)發(fā)利用甚少，且大多是普通葡萄皮渣的開(kāi)發(fā)利用。鄧紅梅等將釀酒皮渣調(diào)整酒精度、糖度來(lái)釀造皮渣醋，獲得總酸5.11%的皮渣醋[3]；徐敏以山葡萄釀酒皮渣為原料，比較山葡萄皮渣醋的抗氧化活性高于市售葡萄醋[4]。文章主要測(cè)定分析了由冰葡萄皮渣和鮮食巨峰葡萄混合釀造而成的冰葡果醋中的黃酮類、多酚類、原花青素和齊墩果酸等功能成分的含量并分別進(jìn)行了體外抗氧化、降血糖和降膽固醇的試驗(yàn)，以期為產(chǎn)品開(kāi)發(fā)提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 原料

冰葡萄皮渣：山西鱻淼酒莊提供；鮮食葡萄：市售巨峰葡萄；冰葡果醋：由冰葡萄皮渣和鮮食葡萄混合釀制而成。

1.1.2 藥品與試劑

蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品：上海藍(lán)季科技發(fā)展有限公司；ABTS 標(biāo)準(zhǔn)品：酷爾化學(xué)科技(北京)有限公司；沒(méi)食子酸標(biāo)準(zhǔn)品：廊坊市拓迪化工有限公司；α-葡萄糖苷酶：上海麥克林生化科技有限公司；對(duì)硝基苯-α-D-葡萄糖吡喃苷(PNPG)：美國(guó)Sigma公司；維生素C、原花青素、齊墩果酸、膽固醇、鄰苯二甲醛(OPA )和 DPPH 標(biāo)準(zhǔn)品：北京索萊寶科技有限公司；無(wú)水乙醇、甲醇、正丁醇、FeSO4、H2O2、福林酚、冰乙酸、水楊酸、二甲基亞砜、磷酸二氫鉀、磷酸氫二鈉等：天津市天力化學(xué)試劑有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

UV-5100紫外可見(jiàn)分光光度計(jì) 上海元析儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 維生素C 的測(cè)定

按照GB/T 5009.86-2003，采用2,4-二硝基苯肼比色法進(jìn)行測(cè)定。繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得回歸方程為：Y=0.05828+0.0222X，R2=0.9987。

1.3.2 總黃酮的測(cè)定

總黃酮的測(cè)定采用比色法，按照文獻(xiàn)[5]的方法進(jìn)行測(cè)定，以蘆丁制備標(biāo)準(zhǔn)曲線。繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得回歸方程為：Y=-0.20139+0.01487X，R2=0.9969。準(zhǔn)確吸取冰葡果醋的稀釋液以及釀造前原液各 0.5 mL，用上述方法進(jìn)行測(cè)定，將得到的吸光值帶入上述回歸方程計(jì)算得出總黃酮的含量。

1.3.3 總多酚的測(cè)定

總多酚的測(cè)定采用比色法，按照文獻(xiàn)[5]的方法進(jìn)行測(cè)定，以沒(méi)食子酸制備標(biāo)準(zhǔn)曲線。繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得回歸方程為：Y=-0.04295+0.03939X，R2=0.9956。準(zhǔn)確吸取冰葡果醋的稀釋液以及釀造前原液各 0.2 mL，用上述方法進(jìn)行測(cè)定，將得到的吸光值帶入上述回歸方程計(jì)算得出總多酚的含量。

1.3.4 原花青素的測(cè)定

原花青素的測(cè)定采用鐵鹽催化比色法，按照文獻(xiàn)[6]的方法進(jìn)行測(cè)定，以原花青素標(biāo)準(zhǔn)品制備標(biāo)準(zhǔn)曲線。繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得回歸方程為：Y=0.00221+0.02515X，R2=0.9960。準(zhǔn)確吸取冰葡果醋的稀釋液以及釀造前原液各 0.1 mL，用上述方法進(jìn)行測(cè)定，將得到的吸光值帶入上述回歸方程計(jì)算得出原花青素的含量。

1.3.5 齊墩果酸的測(cè)定

齊墩果酸的測(cè)定采用紫外分光光度法，按照文獻(xiàn)[7]的方法進(jìn)行測(cè)定，以齊墩果酸標(biāo)準(zhǔn)品制備標(biāo)準(zhǔn)曲線。繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得回歸方程為：Y=0.37428+0.00222X，R2=0.9987。準(zhǔn)確吸取冰葡果醋的稀釋液以及釀造前原液各 0.1 mL，用上述方法進(jìn)行測(cè)定，將得到的吸光值帶入上述回歸方程計(jì)算得出齊墩果酸的含量。

1.3.6 DPPH·清除能力[8,9]

用1 mL的移液槍吸取冰葡果醋的稀釋液0.5 mL于10 mL的比色試管中，加蒸餾水補(bǔ)足2 mL，再加入8.62×10-5mol/L的DPPH 醇溶液2 mL，混勻反應(yīng)30 min，以無(wú)水乙醇作為參比在波長(zhǎng)517 nm處測(cè)其吸光值(Ai)；用1 mL移液槍吸取冰葡果醋的稀釋液0.5 mL于 10 mL的比色試管中，加蒸餾水補(bǔ)足2 mL，再加入無(wú)水乙醇2 mL，混勻反應(yīng)30 min，以無(wú)水乙醇作為參比在波長(zhǎng)517 nm處測(cè)其吸光值(Aj)；在10 mL的比色試管中加入8.62×10-5mol/L的DPPH 醇溶液2 mL，再加入無(wú)水乙醇2 mL，混勻反應(yīng)30 min，以無(wú)水乙醇作為參比在波長(zhǎng)517 nm處測(cè)其吸光值(A0)。

1.3.7 ·OH 清除能力

用1 mL的移液槍吸取冰葡果醋的稀釋液0.6 mL，加蒸餾水補(bǔ)足2 mL，分別依次加入6 mmol/L水楊酸溶液2 mL、6 mmol/L FeSO4溶液2 mL，蒸餾水2 mL，最后加入6 mmol/L H2O2啟動(dòng)反應(yīng)，搖勻，靜置30 min，在波長(zhǎng) 510 nm處測(cè)其吸光值(Ai)；按上述方法，用蒸餾水代替水楊酸，測(cè)其吸光值(Aj)；按上述方法，用蒸餾水代替不同體積的樣液，測(cè)其吸光值(A0)。

用1 mL的移液槍吸取冰葡果醋的稀釋液0.1 mL加入2.9 mL ABTS試劑中，室溫放置10 min，以蒸餾水作為參比在波長(zhǎng)734 nm處測(cè)其吸光值(A1)；用1 mL的移液槍吸取0.1 mL 無(wú)水乙醇加入2.9 mL ABTS試劑中，室溫放置10 min，以蒸餾水作為參比在波長(zhǎng)734 nm處測(cè)其吸光值(A0)。

1.3.9 體外降血糖[10]

用磷酸鹽緩沖液(pH 6.8) 1 mmol/L PNPG，稀釋成25，50，100，150，200，300 μmol/L。分別吸取PNPG溶液各1.6 mL，加入0.2 mol/L Na2CO3溶液0.8 mL，混勻。以空白標(biāo)準(zhǔn)溶液作參比，在波長(zhǎng)為405 nm處測(cè)其吸光度。繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，以確定其回歸方程。在反應(yīng)體系中，加入磷酸鉀緩沖液1.12 mL，加入1×104U/mL的α-葡萄糖苷酶0.2 mL、二甲基亞砜0.08 mL，37 ℃ 恒溫孵育15 min后加入2.5 mmol/L PNPG 0.2 mL，37 ℃ 恒溫反應(yīng)15 min。再加入0.08 mL濃度為0.2 mol/L的Na2CO3溶液，于405 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光值A(chǔ)0，對(duì)應(yīng)標(biāo)準(zhǔn)曲線求得α-葡萄糖苷酶活力C0；加入α-葡萄糖苷酶同時(shí)加入等量冰葡果醋樣液，測(cè)得吸光值A(chǔ)1，計(jì)算得 α-葡萄糖苷酶活力C1。

1.3.10 體外降膽固醇[11]

配制1 mg/mL的膽固醇標(biāo)準(zhǔn)液，精密稱取鄰苯二甲醛10 mg，溶于冰乙酸定容至100 mL，避光保存。溶液配制時(shí)邊加濃硫酸邊振蕩，充分混勻，室溫靜置10 min，以空白標(biāo)準(zhǔn)液作參比，在波長(zhǎng)為550 nm處測(cè)其吸光度。按表 1 進(jìn)行膽固醇標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制，以確定其回歸方程。

表1 膽固醇標(biāo)準(zhǔn)溶液配方Table 1 The formula of cholesterol standard solution

根據(jù)表1測(cè)定標(biāo)準(zhǔn)樣品中的膽固醇含量A0，加入等量的冰葡果醋的稀釋液測(cè)得吸光度 A1，將得到的吸光值帶入上述回歸方程分別計(jì)算得出冰葡果醋中膽固醇的含量C0和C1。

不同酒精度五糧液中共檢測(cè)到的香氣物質(zhì)有52種，其中醇類4種、酸類8種、酯類16種、醛類2種、芳香族類11種、內(nèi)酯1種、其他6種（酮、縮醛、呋喃、含硫化合物等）、未知4種。

2 結(jié)果與分析

2.1 功能成分測(cè)定結(jié)果與分析

表2 功能成分含量Table 2 The content of functional components mg/L

由表2可知，冰葡果醋中含有維生素C 16.47 mg/L、總黃酮44.55 mg/L、總多酚20.06 mg/L、原花青素24.78 mg/L、齊墩果酸112.49 mg/L。經(jīng)過(guò)發(fā)酵后維生素C含量降低，可能是在滅酶或滅菌過(guò)程中，一部分維生素C被破壞；經(jīng)過(guò)發(fā)酵后總黃酮含量顯著增高，表明發(fā)酵過(guò)程促進(jìn)了黃酮類化合物的合成；經(jīng)過(guò)發(fā)酵后總多酚含量顯著增高，表明發(fā)酵過(guò)程有利于多酚類化合物的合成；經(jīng)過(guò)發(fā)酵后原花青素含量降低，可能是在澄清過(guò)程中隨著澄清劑一起沉淀，使得原花青素有部分損失；齊墩果酸在發(fā)酵前后的含量較高，無(wú)顯著變化。

2.2 抗氧化能力

2.2.1 DPPH·清除能力

DPPH·作為一種穩(wěn)定的氮中心自由基，可以清除其他的自由基，通過(guò)加入DPPH后觀察某一化學(xué)反應(yīng)的速率，作為這一反應(yīng)是否具有自由基反應(yīng)本質(zhì)的指標(biāo)。根據(jù)上述公式計(jì)算得冰葡果醋中DPPH自由基清除能力達(dá)到91.68%，蘋果渣醋提取物的DPPH·清除率可達(dá)到 87.9%[12]，山葡萄皮渣醋達(dá)到71%，市售葡萄醋達(dá)到50%。表明冰葡果醋DPPH·清除能力較蘋果渣醋、山葡萄皮渣醋、市售葡萄醋都強(qiáng)。

2.2.2 ·OH 清除能力

羥基自由基(·OH)是最活潑的自由基，也是毒性最大的自由基，它可與活細(xì)胞中的任何分子發(fā)生反應(yīng)而造成損害，且反應(yīng)速度很快。根據(jù)公式計(jì)算得·OH的清除率為29.29%，清除能力較弱。山葡萄皮渣醋達(dá)到54%，市售葡萄醋達(dá)到6.9%。表明冰葡果醋·OH清除能力較山葡萄皮渣醋弱，但遠(yuǎn)高于市售葡萄醋。

2.2.3 ABTS抗氧化能力

ABTS法測(cè)定總抗氧化能力是ABTS在適當(dāng)?shù)难趸瘎┳饔孟卵趸删G色的ABTS+·，在抗氧化物存在時(shí)ABTS+·的產(chǎn)生會(huì)被抑制。根據(jù)方法計(jì)算ABTS+·的清除率為68.34%，總抗氧化能力較強(qiáng)。菠蘿皮渣果醋的ABTS+·清除率在整個(gè)發(fā)酵過(guò)程中逐漸升高，從65.3%升高到81.6%[13]。表明冰葡果醋ABTS+·清除能力較菠蘿皮渣果醋較弱，可能是由于不同原料之間抗氧化能力有差異。

2.3 體外降血糖

α-葡萄糖苷酶是促進(jìn)食物分解為葡萄糖的一種酶，其抑制劑在小腸上與α-葡萄糖苷酶結(jié)合，抑制該酶的活性，使淀粉類分解為麥芽糖進(jìn)而分解為葡萄糖的速度減緩，延緩食物中葡萄糖的吸收。陳樹(shù)俊等試驗(yàn)表明雜糧功能醋粉具有一定的降血糖功能。測(cè)定各梯度的吸光值，制作α-葡萄糖苷酶活力的標(biāo)準(zhǔn)曲線，見(jiàn)圖1。得回歸方程為：Y=0.12509+0.00172X，R2=0.9919。結(jié)果表明，冰葡果醋對(duì) α-葡萄糖苷酶有抑制作用，即有降血糖作用，計(jì)算得出抑制率為42.31%，抑制率與高鈣菊花枸杞酸奶相似[14]。

圖1 α-葡萄糖苷酶的標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.1 Standard curve of α-glucosidase

2.4 體外降膽固醇

膽固醇作為血脂的指標(biāo)之一，是引起人類疾病的重要因素之一[15]。按照上述方法測(cè)得各梯度的吸光值，制作膽固醇測(cè)定的標(biāo)準(zhǔn)曲線，見(jiàn)圖2。得回歸方程為：Y=0.00701+0.00312X，R2=0.9959。測(cè)定吸光值，代入回歸方程中得濃度，并用公式計(jì)算得出冰葡果醋有降膽固醇的作用，且抑制率為14.33%。

圖2 膽固醇的標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.2 Standard curve of cholesterol

3 結(jié)論

冰葡果醋中維生素C、總黃酮、總多酚、原花青素、齊墩果酸的含量分別為16.47，44.55，20.06，24.78，112.49 mg/L。總黃酮和總多酚含量比釀造前原液增高，維生素C和原花青素含量比釀造前原液降低，齊墩果酸含量基本不變。

冰葡果醋對(duì)DPPH的清除能力為91.68%，對(duì)·OH的清除率為29.29%，對(duì)ABTS+·的抑制率為68.34%，對(duì)α-葡萄糖苷酶活力的抑制率為42.31%，對(duì)膽固醇的抑制率為14.33%。

綜上所述，冰葡果醋中的總黃酮和總多酚含量增高，并含有一定量的維生素C、原花青素、齊墩果酸，功能成分多樣，其對(duì)DPPH·的清除能力很強(qiáng)，有較強(qiáng)的抗氧化作用，對(duì)α-葡萄糖苷酶活力有抑制作用，具有一定的降血糖作用，對(duì)膽固醇有一定的抑制作用。