基于PCR-DGGE方法分析泡菜中乳酸菌群落結(jié)構(gòu)

燕平梅，宋敏麗，喬宏萍，趙文婧，陳燕飛

(1.太原師范學(xué)院 生物系，太原 030619; 2.土壤消毒活化綠色產(chǎn)業(yè)技術(shù)創(chuàng)新戰(zhàn)略聯(lián)盟，太原 030619)

我國(guó)地大物博，蔬菜年產(chǎn)量數(shù)億噸，居于世界前列。但由于生產(chǎn)落后，缺少貯藏手段，使得每年的蔬菜損失重大。泡菜在我國(guó)具有悠久的歷史，泡菜的存在大大降低了蔬菜的浪費(fèi)，由于其加工簡(jiǎn)單，味道鮮美，富含維生素、纖維素和蛋白質(zhì)等營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)[1]，具有清腸、抗癌、抗肥胖等功能[2,3]，固而受到人們的青睞。

泡菜是我國(guó)傳統(tǒng)的蔬菜發(fā)酵食品，主要進(jìn)行乳酸發(fā)酵。Jung S L等的研究表明乳酸菌是泡菜發(fā)酵的主要微生物[4,5]。在發(fā)酵過(guò)程中以乳酸菌等有益微生物群體穩(wěn)定且占絕對(duì)優(yōu)勢(shì)，幾乎不發(fā)生污染，發(fā)酵產(chǎn)物甚至可以不用消毒。泡菜中的乳酸菌對(duì)泡菜的色、香、味、品質(zhì)至關(guān)重要[6]，這主要是由于在泡菜的制作過(guò)程中，乳酸菌的代謝產(chǎn)物和所處的低氧環(huán)境抑制了有害微生物的生長(zhǎng)。首先乳酸菌產(chǎn)酸和一些呈味物質(zhì)，其次乳酸菌不能分解纖維素，這使得泡菜有良好的外觀(guān)[7]?？偠灾?，乳酸菌的種類(lèi)和特性與泡菜的風(fēng)味和品質(zhì)緊密相關(guān)。我國(guó)傳統(tǒng)的自然發(fā)酵很難滿(mǎn)足人們對(duì)泡菜的需求，而且發(fā)酵時(shí)間長(zhǎng)，會(huì)使亞硝酸鹽這種致癌物質(zhì)大量積累，危害人們的健康。因此，將泡菜投入到工業(yè)化生產(chǎn)是十分必要的。韓國(guó)泡菜、日式泡菜工業(yè)化生產(chǎn)已經(jīng)達(dá)到了成熟階段，而中國(guó)如四川泡菜的工業(yè)化生產(chǎn)仍處于起步階段，還有待進(jìn)一步發(fā)展。本實(shí)驗(yàn)利用PCR-DGGE技術(shù)可以分離出兩種市售泡菜中不同種的乳酸菌，不僅了解泡菜中乳酸菌的種類(lèi)和分布，而且為泡菜工業(yè)化生產(chǎn)篩選和培育優(yōu)良乳酸菌種奠定了基礎(chǔ)。

張慶芳等人的研究表明乳酸菌能夠降解亞硝酸[8]。這是由于乳酸菌產(chǎn)酸，使得發(fā)酵體系中的pH升高，可以抑制其中有害微生物的生長(zhǎng)，如能夠產(chǎn)生硝酸還原酶的微生物，它們可以將泡菜中富集的硝酸鹽還原成亞硝酸鹽。同時(shí)在H+的作用 下，將NO2-還原成NO-，降低了亞硝酸鹽的含量。亞硝酸鹽能與胺類(lèi)物質(zhì)生成亞硝胺，亞硝胺攝入會(huì)對(duì)人體造成危害，是一種毒性很強(qiáng)的致癌物質(zhì)；另外亞硝酸鹽易引起高鐵血紅蛋白癥，使生物組織缺氧、血管擴(kuò)張、血壓降低[9]。如果能夠?qū)⒔到鈦喯跛猁}能力強(qiáng)的乳酸菌株應(yīng)用于泡菜發(fā)酵，這對(duì)我國(guó)泡菜的生產(chǎn)及推廣具有重要的意義。

自1993年 Muyzer等將變性梯度凝膠電泳技術(shù)引入到微生物生態(tài)學(xué)研究以來(lái)，DGGE 已被廣泛應(yīng)用到各種各樣的生態(tài)系統(tǒng)中微生物群落結(jié)構(gòu)分析[10]。由于自然界中只有極其少的微生物能夠通過(guò)培養(yǎng)法培養(yǎng)[11]，用傳統(tǒng)的分離培養(yǎng)方法研究泡菜中微生物種群構(gòu)成易造成微生物多樣性丟失。梁新樂(lè)等人的研究表明PCR-DGGE是研究傳統(tǒng)發(fā)酵食品中微生物組成的可行性方法[12]。因此，本實(shí)驗(yàn)采用PCR-DGGE技術(shù)來(lái)更加全面地反映泡菜中乳酸菌的多樣性。

1 材料與方法

1.1 樣品

市售白菜泡菜(青島松源食品有限公司)，用P1表示；泡酸菜(四川廣樂(lè)食品有限公司)，用P2表示。

1.2 儀器與設(shè)備

TC-96/G/H(b)B Life Touch基因擴(kuò)增儀 杭州博日科技有限公司；電泳儀、凝膠成像系統(tǒng)DcodeTMBio-Rad公司。

1.3 方法

1.3.1 泡菜鹵亞硝酸鹽及食鹽濃度的測(cè)定

泡菜鹵食鹽濃度測(cè)定方法采用硝酸銀滴定法。亞硝酸鹽測(cè)定方法按GB/T 5009.33-1996的方法。

1.3.2 泡菜鹵中微生物總DNA的提取及16S rDNA V7-V8片段的PCR

使用細(xì)菌基因組DNA提取試劑泡菜中細(xì)菌的DNA。

16S rDNA V7-V8片段的引物分別為：

WBAC1:CGCCCGCCGCGCCCCGCGCCCGGCCCGCCGCCCCCGCCCCCCCGGGAACGTATTCAC-CGCG；WBAC2:GTCGTCAGCTCGTGTCGTGAGA。

PCR反應(yīng)體系中引物1 μL(10 μL)，模板DNA1.5 μL，Mix 12.5 μL，加雙蒸水至25 μL。PCR反應(yīng)后用1.2%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，凝膠成像系統(tǒng)觀(guān)察。

1.3.3 變性劑梯度凝膠電泳分離16S rDNA基因(DGGE)

變性梯度凝膠的配方見(jiàn)表1。

表1 變性梯度凝膠的配方Table 1 The formula of denaturing gradient gel

DGGE電泳后，將可看到的電泳帶切割回收，作為模板進(jìn)行PCR反應(yīng)，將擴(kuò)增后的16S rDNA V7-V8片段與pGM-T Vector連接，轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞。檢測(cè)陽(yáng)性克隆，進(jìn)行基因序列測(cè)定。

1.3.4 DGGE條帶結(jié)構(gòu)多樣性分析

DGGE圖譜上每個(gè)條帶的位置和相對(duì)光密度值被該Quantity One軟件自動(dòng)分析確定。數(shù)據(jù)的標(biāo)準(zhǔn)化處理用電泳條帶的光密度峰值除以該條帶所在泳道所有條帶光密度峰值的平均值。DGGE泳道內(nèi)的電泳條帶數(shù)量用以計(jì)算物種豐富度(Species Richness，用R表示)，運(yùn)用電泳條帶相對(duì)密度值計(jì)算物種均勻度(Species Evenness，用E表示)及物種多樣性(Shannon，用H表示)。3種生態(tài)指數(shù)的計(jì)算公式為：

H=-∑(ni/N)In(ni/N)；

E=H/InS；

R=S-1/InN。

式中：ni為單一條帶的峰面積，N為某一泳道的所有峰面積，S為某一泳道的總條帶數(shù)。

1.3.5 系統(tǒng)發(fā)育分析方法

將得到的16S rDNA V7-V8目的片段序列提交到GenBank中進(jìn)行BLAST比對(duì)，選出與目的片段相似度高的序列，利用MEGA 4.0軟件的Neighbor-Joining法構(gòu)建16S rDNA的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)，進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育分析。

2 結(jié)果及分析

2.1 泡菜中食鹽濃度和亞硝酸鹽的含量

采用滴定方法測(cè)定兩種泡菜的氯化鈉濃度，結(jié)果見(jiàn)表2。泡菜P1的食鹽濃度是P2的2.11倍。

采用分光光度法測(cè)定兩種泡菜的亞硝酸鹽含量，結(jié)果見(jiàn)表2。泡菜P1的亞硝酸含量是P2的2.35倍。但是兩種泡菜中亞硝酸鹽含量遠(yuǎn)低于我國(guó)GB 2762—2012中規(guī)定的亞硝酸鹽限量指標(biāo)(20 mg/kg)。

表2 不同泡菜中食鹽含量Table 2 The salt content in different pickles

2.2 PCR-DGGE實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.2.1 泡菜中16S rDNA V7-V8片段的PCR擴(kuò)增

將從泡菜汁中提取出的DNA用25 μL的反應(yīng)體系進(jìn)行PCR擴(kuò)增，所用的引物為WBAC1和WBAC2，再將擴(kuò)增出的PCR產(chǎn)物進(jìn)行電泳分析，結(jié)果見(jiàn)圖1。

圖1 16S rDNA片段的PCR擴(kuò)增 瓊脂糖凝膠電泳圖譜Fig.1 The agarose gel electrophoresis map of 16S rDNA fragment by PCR amplification

由圖1可知，16S rDNA V7-V8區(qū)的擴(kuò)增片段的大小在370～380 bp左右。擴(kuò)增條帶清晰、無(wú)雜帶，能夠進(jìn)行DGGE實(shí)驗(yàn)。

2.2.2 泡菜16S rDNA V7-V8基因的DGGE分析

DGGE電泳結(jié)果中，有不同遷移率和明亮程度不同的電泳條帶，每一全條帶代表不同種屬的乳酸菌，電泳條帶亮度程度反映了乳酸菌的相對(duì)數(shù)量，條帶越亮，表示該種屬細(xì)菌的相對(duì)數(shù)量越多。

圖2 泡菜中乳酸菌16S rDNA片段的DGGE圖譜Fig.2 DGGE map of 16S rDNA fragment of Lactobacillus in pickles

由圖2可知，本次實(shí)驗(yàn)共檢測(cè)出了10個(gè)條帶。泡菜P1檢測(cè)到3條帶A、B、C，即有3種乳酸菌；泡菜P2檢測(cè)到7個(gè)條帶D、E、F、G、H、I、J，即有7種乳酸菌。說(shuō)明泡菜P2中的乳酸菌種類(lèi)較泡菜P1中的豐富。A與H位置相同，為同一種乳酸菌。P1中A和C的亮度最亮，說(shuō)明乳酸菌A和C是泡菜P1乳酸菌中的優(yōu)勢(shì)種；P2中J的亮度最亮，說(shuō)明乳酸菌J是泡菜P2乳酸菌中的優(yōu)勢(shì)種?？梢?jiàn)，同一種乳酸菌在不同的泡菜中所處的地位是不同的。

2.2.3 泡菜中乳酸菌群落特征

通過(guò)Quantity One軟件分析DGGE電泳圖譜，以電泳條帶數(shù)量計(jì)算物種豐富度，以電泳帶相對(duì)密度值計(jì)算乳酸菌均勻度及多樣性。多樣性指數(shù)、均勻度和豐富度3種生態(tài)指數(shù)是衡量群落的種類(lèi)數(shù)、個(gè)體總數(shù)以及各種群均勻程度的量化指標(biāo)，反映群落結(jié)構(gòu)特征的量度值、群落結(jié)構(gòu)的特征及差異性。泡菜P2中乳酸菌多樣性指數(shù)和豐富度指數(shù)顯著高于泡菜P1，均勻度指數(shù)無(wú)顯著差異，見(jiàn)表3。

表3 泡菜微生物乳酸菌群落結(jié)構(gòu)特征Table 3 The community structure of characteristics of lactic acid bacteria in pickles

3 討論

本實(shí)驗(yàn)以市售的兩種泡菜為研究對(duì)象，測(cè)定不同泡菜的食鹽濃度及亞硝酸鹽含量，運(yùn)用PCR-DGGE技術(shù)分析了這兩種泡菜中乳酸菌的多樣性，多方面結(jié)合比較。泡菜P1中的食鹽濃度和亞硝酸鹽含量都高于泡菜P2，而泡菜P1中的乳酸菌豐富度低，這是由于高鹽導(dǎo)致乳酸菌受到抑制，而乳酸菌又能夠降解亞硝酸鹽。

食鹽含量對(duì)微生物群落結(jié)構(gòu)影響很大[13]。泡菜微生物群落成員對(duì)食鹽濃度的耐受性不同。通常高濃度食鹽(10%～16%)有利于酵母菌生長(zhǎng)，而低濃度食鹽(5%～8%)則有利于乳酸菌生長(zhǎng)[14]。在低溫下，6%的食鹽濃度比8%的能更好地促進(jìn)乳酸菌生長(zhǎng)。

自從PCR-DGGE技術(shù)應(yīng)用于研究微生物物種的多樣性，對(duì)發(fā)酵食品中微生物的物種多樣性研究甚多。對(duì)其中乳酸菌的多樣性研究也頗多，如蔣厚陽(yáng)運(yùn)用PCR-DGGE對(duì)西藏傳統(tǒng)發(fā)酵乳制品中的乳酸菌多樣性進(jìn)行了研究[15]。相比之下，本實(shí)驗(yàn)的不足：沒(méi)有對(duì)DGGE的條帶進(jìn)行測(cè)序，只對(duì)DGGE的圖譜進(jìn)行了分析，利用Quantity One軟件分析了PCR-DGGE的圖譜，計(jì)算出了反映乳酸菌多樣性的指數(shù)。