植物功能鹽對小鼠急性化學性肝損傷的防護實驗研究

陳亮，周沫希，嚴雅麗，張英

(浙江大學生物系統(tǒng)工程與食品科學學院，浙江省農產品加工技術研究重點實驗室， 浙江省食品加工技術與裝備工程研究中心，杭州 310058)

傳統(tǒng)的“竹鹽”是將粗的海鹽(又稱原鹽)放入新鮮的楠竹筒中，在800～1300 ℃的高溫下反復烤制而成，著名的“紫竹鹽”就是通過9次循環(huán)填充、烤制得到的，故又稱九烤竹鹽，以韓國產的“仁山紫竹鹽”最為有名[1,2]。已有研究表明，竹鹽具有保護胃腸道[3]、減輕肝腎負擔[4]、抑菌消炎[5,6]、護膚養(yǎng)顏等功效[7,8]。筆者科研團隊前期的研究工作也已證明，紫竹鹽能夠防止血液酸化，對慢性代謝性酸中毒大鼠的腎臟疾病具有良好的防護效果。

本文所涉及的“植物功能鹽”是筆者科研團隊近年來發(fā)明的新產品，是將原鹽與不同的植物提取物適量混合后，采用特殊的高溫熔煉技術得到的不同色澤的功能性鹽，如紫色的竹鹽、粉色的松鹽和綠色的梅鹽，即是由竹、松、梅等植物提取物與原鹽在高溫下共融后重結晶而成。調整植物提取物的種類及其與原鹽的比例關系、烤制的溫度和時間、不同溫度下的保溫時間及其升降溫速率等工藝參數，即可獲得不同形態(tài)、不同風味和不同功能的植物鹽系列產品[9]。

眾所周知，肝臟是人體最大的代謝和解毒器官，因而也是最容易遭受毒物攻擊的靶標[10]。近年來，急性肝損傷的發(fā)病率呈逐年增加的趨勢，藥物濫用約占臨床急性肝損傷發(fā)病率的50%[11,12]，占非病毒性慢性肝炎患者的20%～50%[13,14]，占爆發(fā)性肝功能衰竭患者的15%～30%[15]；急性肝損傷更易對兒童造成永久性傷害，臨床上約有20%的肝功能衰竭者為兒童[16]。當前，治療化學性肝損傷的主要藥物有肌醇、肝泰樂、聯苯雙酯等。其中，聯苯雙酯(Bifendatatum)是治療病毒性肝炎和藥物性肝損傷的常用藥物，認為能保護肝細胞、增加肝臟解毒功能，尤其是能顯著抑制轉氨酶活性的升高，且毒性低，副作用小。

本文擬采用四氯化碳(CCl4)誘導的急性小鼠肝損傷模型，以仁山紫竹鹽為陽性食物對照、聯苯雙酯為陽性藥物對照，評價3種植物鹽(竹鹽、松鹽和梅鹽)對小鼠急性化學性肝損傷的保護作用，以期為這種新型植物功能鹽在食品、健康、醫(yī)療、保健領域中的應用提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 原材料與儀器設備

原鹽(日曬海鹽)來自山東濰坊，實測NaCl含量為93.36%。3種植物功能鹽：竹鹽(外觀藍紫色，NaCl含量為88.83%)、松鹽(粉紅色，NaCl含量為90.32%)和梅鹽(亮綠色，NaCl含量為91.74%)均由筆者實驗室自制，即將原鹽與不同比例的竹鹽、松鹽、梅鹽提取物混合均勻后，在800～1400 ℃的高溫下熔煉而成；仁山紫竹鹽為市售產品，韓國Insan竹鹽有限公司出品；聯苯雙酯滴丸，北京協(xié)和藥廠生產；化學純NaCl，Sigma產品。

5周齡雄性C57BL/6小鼠，平均體質量為(16.0±2.0) g，購自上海斯萊克實驗動物有限公司，由上海市實驗動物質量監(jiān)督檢驗站鑒定，合格證號為SCXK(滬) 2017-0005。動物實驗的倫理認證編號為10319#(浙江中醫(yī)藥大學動物實驗中心)。小鼠常規(guī)飼料(含2%食鹽)由南通特洛菲飼料科技有限公司提供，同時委托其專門加工了無鹽基礎飼料。

丙二醛(MDA)測定試劑盒(TBA法)、總超氧化物歧化酶(T-SOD)測試盒(羥胺法)、還原型谷胱甘肽(GSH)測定試劑盒(微板法)、谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-Px)測定試劑盒(比色法)，均購自南京建成生物工程研究所。

全自動生化檢測儀 日本Hitachi儀器公司；Thermo Varioskan Flash酶標儀 美國Thermo Fisher Scientific公司；CKX41顯微鏡 日本奧林巴斯株式會社。

1.2 試驗方法

1.2.1 動物分組與試驗設計

取5周齡的SPF級C57BL/6健康雄性小鼠45只，適應性喂養(yǎng)1周后隨機分成9組，試驗設計及劑量配制見表1。

表1 動物試驗分組及給藥劑量Table 1 Grouping and dosing of animal test

注：為了確保試驗數據的可比性，正常對照組分別設置了含2%食鹽的常規(guī)飼料組(1#)和灌胃等質量的純NaCl水溶液、同時攝食無鹽飼料的對照組(2#)。

除正常對照組(1#)采用常規(guī)飼料外，其余8組均使用無鹽基礎飼料。給藥階段，根據世界衛(wèi)生組織推薦的每人每日食鹽攝入量5 g及標準動物等效劑量折算法得出小鼠的口服劑量[17]，每日灌胃1次，連續(xù)21天。飼養(yǎng)環(huán)境溫度為(22±2)℃，相對濕度為50%～70%。

1.2.2 急性肝損傷動物造模

末次給藥1 h后，模型對照組和試驗組(3#～9#)小鼠均腹腔注射0.1% 的CCl4橄欖油溶液，CCl4劑量為10 mL/kg·bw，正常對照組(1#～2#)給予等體積的橄欖油，禁食過夜[18]。

1.2.3 試樣采集及生化指標測定

在注射CCl4橄欖油溶液16 h后，脊椎脫臼處死小鼠，立刻摘眼球取血，同時解剖小鼠取肝臟。

血液樣本，經3500 r/min離心10 min后，吸取上層血清用于血生化指標測定。取出完整肝臟后，剪取0.4 g肝臟組織1份，放入裝有PBS(pH為7.4)的凍存管中勻漿，其余肝臟組織放入凍存管中，于-80 ℃冰箱中保存留用。將剪取的0.4 g肝臟勻漿后置于超低溫離心機中離心(4000 r/min、20 min)，取上清液，測定其丙二醛(MDA)、谷胱甘肽(GSH)的含量以及總超氧化物歧化酶(T-SOD)、谷胱甘肽過氧化酶(GSH-Px)的活性(考馬斯亮藍法)[19]。

1.2.4 肝組織的病理觀察

取各組試驗鼠相同部位的肝組織，冷生理鹽水沖洗干凈后用中性福爾馬林固定，制作4 μm的石蠟切片，進行HE染色，在顯微鏡下觀察其形態(tài)學的變化。

1.3 統(tǒng)計方法

試驗數據均采用平均值±標準誤差(x±s)表示，對數據進行方差齊性檢驗；組間數據比較采用單因素方差分析。使用SPSS 19.0統(tǒng)計軟件的單因素方差分析(ANOVA)中的Duncan檢驗分析顯著性，P<0.05為差異顯著，P<0.01為差異極顯著。

2 結果與分析

2.1 植物功能鹽對試驗小鼠體重的影響

在為期21天的試驗周期內，各試驗組小鼠的體質量隨飼養(yǎng)時間的延長而增長，均未表現出顯著性差異(P>0.05)；同時觀察到各組小鼠皮毛光滑，臨床活動表現均正常，健康狀況良好。試驗周期中不同時間節(jié)點采集的各組試驗小鼠的體質量情況見表2。

表2 試驗周期中各試驗組小鼠的體質量比較Table 2 Comparison of body weights of mice in each experimental group during the experiment period

注：同一列兩兩之間若字母完全不同，則兩者之間存在顯著差異(P<0.05)。

2.2 植物功能鹽對化學性肝損傷小鼠血清中轉氨酶活性的影響

表3 各試驗組小鼠血清中轉氨酶活性的比較Table 3 Comparison of activities of ALT and AST in serum of mice in each experimental group

注：同一列兩兩之間若字母完全不同，則兩者之間存在顯著差異(P<0.05)；模型對照組(3#)與NaCl對照組(2#)相比，“#”表示P<0.01；各試驗組(4#～9#)與模型對照組(3#)相比，“*”表示P<0.01。

由表3可知，模型組(3#)小鼠血清谷氨酸轉氨酶(ALT)和天冬氨酸轉氨酶(AST)活性均極顯著地高于正常對照組(2#和1#)(P<0.01)，表明造模成功。3種植物功能鹽均表現出不同程度的降低血清轉氨酶的活性，而原鹽幾乎無作用。與模型組相比，3種植物功能鹽抑制ALT活性升高的作用極其顯著(P<0.01)；在抑制AST活性升高上，3種植物功能鹽也有極顯著(P<0.01)的作用，表明竹鹽、松鹽和梅鹽具有一定的保肝護肝功效。松鹽對CCl4所致的急性肝損傷小鼠血清轉氨酶急劇升高的抑制作用優(yōu)于竹鹽和梅鹽。然而，陽性藥物對照組(聯苯雙酯)雖然具有最強的抑制ALT活性的功效，但卻對AST無作用。市售的仁山紫竹鹽也和原鹽一樣，未表現出對急性化學性肝損傷小鼠血清轉氨酶活性的抑制作用。

2.3 植物功能鹽對化學性肝損傷小鼠氧化應激指標的影響

試驗動物受到化學毒物攻擊時，急性肝損傷的一個重要表征是強烈的氧化應激反應，即，伴隨著肝臟組織中脂質過氧化導致的MDA含量升高、GSH水平降低、SOD活力下降等。由表4可知，同樣攝入無鹽飼料，并同時灌胃4%純NaCl的兩組(2#和3#)用CCl4造模以后，各項氧化應激指標都發(fā)生了顯著變化，尤其是GSH和MDA水平的改變極其顯著(P<0.01)，表明灌胃CCl4后動物的肝臟受到了氧化損傷。

表4 各試驗組小鼠肝臟組織的抗氧化活性比較Table 4 Comparison of antioxidant activity in liver tissue of mice in each experimental group

注：同一列兩兩之間若字母完全不同，則兩者之間存在顯著差異(P<0.05)；模型對照組(3#)與NaCl對照組(2#)相比，“#”表示P<0.01；各試驗組(4#～9#)與模型對照組(3#)相比，“*”表示P<0.01。

由表4可知，3種植物功能鹽均可一定程度地升高，受損肝臟的GSH含量，其中梅鹽表現出極顯著(P<0.01)的提升作用；且均能降低受損肝臟的MDA含量，其中作用最強的是梅鹽(P<0.01)，其次是仁山紫竹鹽和松鹽(P<0.05)；聯苯雙酯組也表現出升高GSH和降低MDA含量的作用，但效果均不如梅鹽。在提升受損肝臟內源性抗氧化酶活性方面，3種植物功能鹽均表現出一定作用，其中竹鹽表現出對T-SOD活性的顯著提升作用(P<0.05)。

2.4 試驗動物肝臟損傷及其修復的組織病理學觀察

各組小鼠肝組織病理切片的形態(tài)學觀察結果見圖1。

1#和2#是正常小鼠的肝組織，可見肝細胞索排列整齊，細胞邊界清晰，細胞核型正常，無明顯異常；3#NaCl模型組的肝細胞索排列紊亂，細胞核型發(fā)生明顯變化，中央靜脈中有大量細胞浸潤；4#聯苯雙酯組的肝細胞索排列較清晰，細胞核型正常，有少量空泡變性，表明聯苯雙酯滴丸對急性肝損傷有治療作用；5#仁山紫竹鹽組的肝細胞索排列較清晰，細胞核型正常，有少量空泡變性和水樣變性；6#原鹽對照組的肝細胞索排列不整齊，細胞核型發(fā)生明顯變化，中央靜脈中有大量細胞浸潤；7#竹鹽試驗組的肝細胞索排列較清晰，細胞邊界清晰，細胞核型正常，有少量空泡變性；8#梅鹽試驗組的肝細胞索排列清晰，細胞核型正常，有少量空泡變性；9#松鹽試驗組的肝細胞索排列較清晰，細胞核型正常，有少量空泡變性，中央靜脈中有少許細胞浸潤。根據肝臟組織病理切片的形態(tài)學檢查結果，可見竹鹽、松鹽、梅鹽均對CCl4所致的小鼠急性肝損傷有一定的防護作用。

圖1 植物功能鹽對試驗小鼠肝臟組織病理學的影響(×400)Fig.1 Effect of plant functional salts on liver histopathology in experimental mice(×400)

注：1#為常規(guī)飼料對照組；2#為NaCl對照組；3#為NaCl模型組；4#為聯苯雙酯組；5#為仁山紫竹鹽組；6#為原鹽對照組；7#為竹鹽試驗組；8#為梅鹽試驗組；9#為松鹽試驗組。

3 討論

我國是世界肝病大國，預測到2020年，慢性肝病人數將達4.5億。肝病高發(fā)的國情在很大程度上與食物來源、飲用水、飲食習慣和餐飲方式等有關。我國居民的食用鹽主要來自海鹽，日曬海鹽(原鹽)即海水的濃縮物，海洋中所有的污染物都有可能留存其中，帶來一定的食品安全隱患。本研究結果顯示，攝入原鹽的試驗小鼠(6#)肝臟中GSH水平極顯著地(P<0.01)低于攝入同等劑量純NaCl的組(2#)，(871.63±4.67)～(919.71±32.44) nmol/g prot，表明原鹽中的確可能存在一些對肝臟不利的危害因素，引起了肝臟的氧化應激。與此同時，3種植物功能鹽均可顯著抑制ALT(P<0.01)和AST(P<0.05)的活性升高，而原鹽卻無作用。

在本研究的試驗設計中，為了排除小鼠日糧中食鹽的干擾，專門定制了無鹽的基礎飼料用于2#～9#小鼠喂養(yǎng), 除聯苯雙酯的陽性藥物對照組外，各試驗組的食鹽攝入量均為800 mg/kg·bw·d左右。在為期21 天的干預試驗后，最終結果顯示，仁山紫竹鹽(5#)與原鹽(6#)對小鼠血清轉氨酶活性無明顯影響，說明采用傳統(tǒng)方法烤制的竹鹽從竹筒中吸收到的有效成分是有限的。然而，2013年有文獻報道[20]，傳統(tǒng)方法烤制的竹鹽可以抑制CCl4誘導的SD大鼠急性肝損傷，其試驗設計采用常規(guī)含鹽飼料作為大鼠(7周齡)日糧，并在此基礎上灌胃400 mg/kg·bw·d的試樣精鹽、原鹽、一烤竹鹽和九烤竹鹽(即紫竹鹽)，連續(xù)灌胃14 天，結果表明竹鹽可顯著降低SD大鼠血清中的ALT和AST水平(P<0.05)，且九烤的效果優(yōu)于一烤，與此同時原鹽對照組也表現出了一定的活性。導致本研究結果與文獻報道不符的原因可能是多方面的，譬如：原鹽來自不同的海域，其附帶的成分具有顯著差異；試驗劑量的不同，文獻[21]并未排除日糧中食鹽的干擾，常規(guī)日糧以2.0 %的含鹽量計，大鼠通過日糧攝入的食鹽約為1000 mg/kg·bw·d，再加上400 mg/kg·bw·d的試驗鹽，其總攝入量為1400 mg/kg·bw·d，遠高于本研究的試驗劑量(約800 mg/kg·bw·d)；采用傳統(tǒng)工藝生產的竹鹽難以實現標準化，故不同來源的竹鹽樣品可能存在顯著差異。

筆者認為，植物功能鹽的保肝護肝作用主要源自兩個方面：一是與原鹽共融的植物提取物，二是高溫熔煉的過程。對于植物功能鹽來說，雖然所添加的某種植物化學素(或植物提取物)原型物具有保肝護肝的作用，但經過800～1300 ℃的高溫熔煉，其中的有機質應已完全失去，可能僅是剩余的無機物與原鹽發(fā)生了反應，從而使得食鹽的晶體結構、理化特性等隨之發(fā)生改變, 進而影響其生物學功效。如陳湄沁測得5%的竹鹽水溶液的pH值為10.98，而同等濃度的原鹽水溶液為5.99；同時竹鹽較原鹽含有更多的鉀、鈣、鈉、鎂、銅、鋅和鐵等元素；并由此通過體內及體外實驗，發(fā)現了竹鹽對慢性酸中毒以及胃腸道癌癥的作用。文獻[21]測得10%的竹鹽水溶液的pH達11.04，且比原鹽和精制鹽含更多的鉀、鈣、鎂和錳元素；同時竹鹽還表現出更高的電位還原能力，含有更多的羥基，有更好地清除自由基的能力。以上文獻中提到的竹鹽理化特性的變化均引起了生物學效應的改變，而對于晶體結構與生物學效應之間的關聯，還有待進一步的研究，文獻[22]表明食鹽的顏色與NaCl晶格的著色中心有關?？傊?，鑒于食鹽與人類健康之間的高度關聯性，這是一個亟待進行深入系統(tǒng)的研究和探索的領域。