基于生物信息學(xué)的乳腺癌治療藥物的篩選及其分子機(jī)制研究

廖思帆，吳麗媛，梁碧怡，李煥丹，周漩

(廣東藥科大學(xué)藥學(xué)院，廣東 廣州 510006)

乳腺癌是女性常見的惡性腫瘤之一，發(fā)病率和死亡率居婦女各類惡性腫瘤之首，嚴(yán)重威脅著女性的身體健康[1]。近年來乳腺癌的治療手段不斷發(fā)展，手術(shù)治療、化學(xué)治療、靶向治療等多種臨床治療手段已經(jīng)日趨成熟，但由于乳腺癌本身具有高度異質(zhì)性[2]及易轉(zhuǎn)移性等特點，乳腺癌患者的死亡率仍然得不到有效的控制。因此，篩選更有效的乳腺癌治療藥物，延長病人的生存期和降低乳腺癌的死亡率，具有重要意義。

傳統(tǒng)的藥物研發(fā)是一個復(fù)雜而漫長的過程，需要耗費大量的人力物力，才能找到較為行之有效的候選藥物?；虮磉_(dá)譜芯片可以同時觀察成千上萬個基因在不同個體、不同組織、不同發(fā)育階段的表達(dá)狀況[3]，根據(jù)基因在不同條件下的表達(dá)差異性來進(jìn)行藥物篩選，可為藥物研發(fā)提供方向，加快藥物的發(fā)現(xiàn)。

因此，本文采用生物信息學(xué)方法對乳腺癌相關(guān)基因表達(dá)譜數(shù)據(jù)進(jìn)行挖掘分析，篩選乳腺癌候選治療藥物，并對篩選得到的候選藥物進(jìn)行生物學(xué)通路、作用靶點等分析，研究其分子機(jī)制，加快乳腺癌藥物研發(fā)的進(jìn)程，為乳腺癌臨床治療研究提供理論參考。

1 數(shù)據(jù)集

本文研究所用的乳腺癌基因表達(dá)譜數(shù)據(jù)來自于NCBI的GEO數(shù)據(jù)庫(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/ geo/)的GPL570平臺，包括GSE29044、GSE42568、GSE9309和GSE50428。其中，GSE29044包括73個乳腺癌組織與36個正常乳腺組織，共109個樣本；GSE42568包括104個乳腺癌組織與17個正常乳腺組織，共121個樣本；GSE9309包括128個乳腺癌組織與9個正常乳腺組織，共137個樣本；GSE50428包括26個乳腺癌組織與5個正常乳腺組織，共31個樣本。

2 方法與結(jié)果

2.1 篩選差異基因

GEO2R[4]是一個在線的芯片分析工具，可用于比較兩組或多組樣品的差異表達(dá)基因。本文采用GEO2R對前述4個樣本集分別進(jìn)行基因差異表達(dá)分析，將樣本分為正常組與癌癥組，以P<0.01篩選得到差異基因，根據(jù)篩選所得差異基因?qū)?yīng)的LogFC值，>2的即為上調(diào)基因，<-2的即為下調(diào)基因。對4個樣本集的差異基因取交集，獲得共同差異表達(dá)基因138個，其中上調(diào)表達(dá)基因12個，下調(diào)表達(dá)基因126個(見表1)。

2.2 CMAP篩選候選治療藥物

為了篩選有價值的乳腺癌候選治療藥物，采用Connectivity Map[5]對上述共同差異基因進(jìn)行分析，在基因水平上對藥物進(jìn)行篩選。CMAP是一個藥物作用基因表達(dá)數(shù)據(jù)庫，搜集了大量小分子藥物處理過的腫瘤細(xì)胞表達(dá)譜的變化模式。CMAP可通過比較正常樣本與腫瘤樣本的基因表達(dá)差異，基因富集分析算法得到相關(guān)藥物，當(dāng)富集分?jǐn)?shù)為負(fù)數(shù)時，意味著此藥物能夠反向作用于差異表達(dá)模式，以此篩選與腫瘤相關(guān)的藥物。以乳腺癌差異表達(dá)基因為query signature，與CMAP數(shù)據(jù)庫中的藥物基因表達(dá)譜數(shù)據(jù)進(jìn)行配對，篩選得到的藥物相關(guān)實驗次數(shù)越多，負(fù)性富集分?jǐn)?shù)越高，其與乳腺癌的相關(guān)性越強(qiáng)。按實驗次數(shù)大于3，富集分?jǐn)?shù)小于-0.5進(jìn)行篩選，得到100多個相關(guān)藥物，這些藥物可較好地逆轉(zhuǎn)乳腺癌的基因表達(dá)譜。

表1 4個數(shù)據(jù)集的共同差異表達(dá)基因Table 1 Common differential expression genes in four datasets

篩選得到的候選治療藥物中，部分藥物為已知抗腫瘤藥物(見表2)，其中甲氨蝶呤是已知明確的乳腺癌治療藥物，說明了篩選結(jié)果的可靠性。此外，篩選得到的藥物還包括有激素類藥物，如甲羥孕酮、左炔諾孕酮等；抗菌類藥物，如克霉唑、硫鏈絲菌肽等；抗病毒類藥物，如三氟尿苷、阿糖腺苷等；抗組胺類藥物，如地普托品等；心血管類藥物、抗抑郁類藥物等。

表2 篩選得到的候選治療藥物中已知抗腫瘤藥物Table 2 Known anti-tumor drugs of the screened candidate therapeutic drugs

篩選得到的候選治療藥物中，已知的具有抗腫瘤作用的藥物應(yīng)為后期研究的重點。本文從實驗次數(shù)、富集分?jǐn)?shù)、已知抗腫瘤作用等多方進(jìn)行比較，首先選擇了白藜蘆醇、芹黃素、棉酚3個藥物進(jìn)行其抗乳腺癌分子機(jī)制的研究。其中，白藜蘆醇和芹黃素已有報道其干預(yù)乳腺癌細(xì)胞的實驗研究，但并未成為正式的乳腺癌治療藥物；而棉酚則只報道了抗其他腫瘤的作用。本文采用生物信息學(xué)方法，分析這些藥物的靶蛋白及其與乳腺癌相關(guān)基因的相互關(guān)系，研究其治療乳腺癌的分子機(jī)制，為藥物治療乳腺癌提供理論依據(jù)，也為其他藥物的進(jìn)一步分析和篩選提供思路。

除了表2中的已知抗腫瘤藥物，候選治療藥物中的其他類藥物也同樣具有可能的抗乳腺癌作用。部分糖皮質(zhì)激素和雌激素已被證明有抗腫瘤活性，其中甲羥孕酮是明確的乳腺癌治療藥物?？咕愃幬锟赏ㄟ^干擾和抑制細(xì)胞的生長繁殖過程而殺滅細(xì)菌和病原微生物，而近年來研究發(fā)現(xiàn)，抗生素對于癌細(xì)胞也具有相同作用，對有癌變趨勢的細(xì)胞使用抗生素，可抑制癌細(xì)胞的生長與擴(kuò)散，表現(xiàn)出抗癌活性。抗病毒藥物可用于治療或輔助治療惡性腫瘤，而抗組胺藥能夠干擾髓源性抑制細(xì)胞的功能，亦有可能成為候選抗癌藥。心血管類藥物目前沒有發(fā)現(xiàn)有直接的抗癌作用，可能是因為某些癌癥治療藥物具有心血管毒性，引發(fā)心血管并發(fā)癥從而使癌癥病人的基因表達(dá)譜與心血管類藥物的治療譜類似；抗抑郁類藥物亦可同理解釋，這兩類藥物具有抗癌活性的可能性相對較小。

2.3 候選藥物抗乳腺癌機(jī)制分析

2.3.1 藥物靶蛋白 在NCBI的PubChem Compound[6]中，分別搜索白藜蘆醇、芹黃素、棉酚的靶蛋白，白藜蘆醇得到NQO2等95個靶蛋白，芹黃素得到ESR1等48個靶蛋白，棉酚得到THRB等50個靶蛋白。

在Genecard[7]數(shù)據(jù)庫中尋找已知與乳腺癌相關(guān)基因，得到了BRCA1等308個乳腺癌相關(guān)基因。

2.3.2 靶蛋白String分析 String[8]是1個由已知或預(yù)測的蛋白質(zhì)相互作用數(shù)據(jù)組成的數(shù)據(jù)庫(基因則被識別為相應(yīng)的編碼蛋白質(zhì))，它主要用于構(gòu)建蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡(luò)，并通過聯(lián)合其他平臺進(jìn)行GO和KEGG富集等分析，有助于挖掘核心的調(diào)控基因。分別對各藥物的靶蛋白以及乳腺癌相關(guān)基因進(jìn)行String分析，尋找各藥物靶蛋白與乳腺癌相關(guān)基因之間的共同KEGG通路和位點，結(jié)果見表3。共同通路可以反映藥物發(fā)生治療作用的生物通路，共同位點則應(yīng)為藥物可對乳腺癌發(fā)生作用的關(guān)鍵靶蛋白，如白藜蘆醇可能通過作用于AKT1、TP53、PTGS2等位點來發(fā)生抗乳腺癌作用。表3中共同位點包括有,BRCA1、ESR1等典型乳腺癌基因，說明了本文篩選候選治療藥物結(jié)果的合理性，其他位點則為乳腺癌靶向治療提供了新的參考方向。靶向治療特異性強(qiáng)，效果顯著，針對乳腺癌發(fā)生、發(fā)展有關(guān)的信號通路進(jìn)行靶向藥物的開發(fā)與臨床應(yīng)用亦是乳腺癌治療研究的熱點[9]。

Cytoscape[10]是1個生物網(wǎng)絡(luò)的綜合分析和可視化工具，它的中心組織原則是1個網(wǎng)絡(luò)圖，其中生物實體(如基因、蛋白質(zhì)等)為節(jié)點，生物相互作用表示為節(jié)點之間的邊。采用cystocape軟件對各藥物的靶蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)進(jìn)行可視化及拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)分析，分析網(wǎng)絡(luò)中的中心節(jié)點(度數(shù)和介數(shù)高的基因)，結(jié)果見圖1和表4。這些網(wǎng)絡(luò)中心節(jié)點在網(wǎng)絡(luò)中起到關(guān)鍵調(diào)控作用，部分與表3中的關(guān)鍵靶蛋白重合，進(jìn)一步說明了這些靶蛋白的重要性；而與關(guān)鍵靶蛋白未發(fā)生重合的網(wǎng)絡(luò)中心節(jié)點，則應(yīng)是通過調(diào)控關(guān)鍵靶蛋白而間接實現(xiàn)藥物作用。

表3 各藥物靶蛋白String-KEGG通路富集分析結(jié)果Table 3 String-KEGG pathway enrichment analysis of target proteins of the screened drugs

A.白藜蘆醇; B.芹黃素; C.棉酚。

3 小結(jié)

本文采用生物信息學(xué)方法，從GEO數(shù)據(jù)庫中收集與乳腺癌相關(guān)的基因表達(dá)譜數(shù)據(jù)并進(jìn)行分析，篩選乳腺癌候選治療藥物。篩選得到的藥物主要包括有以白藜蘆醇、芹黃素、棉酚為代表的抗腫瘤類藥物，還包括激素類、抗菌類等藥物，這些藥物可較好地逆轉(zhuǎn)乳腺癌的基因表達(dá)譜，有望成為乳腺癌的候選治療藥物或輔助治療藥物，對乳腺癌的治療研究具有重要意義。此外，本文還對白藜蘆醇、芹黃素和棉酚進(jìn)行了藥物抗乳腺癌機(jī)制的研究，分析藥物治療乳腺癌的作用靶點，為乳腺癌靶向治療提供了新的參考方向。