復(fù)方貞術(shù)調(diào)脂方非糖脂代謝依賴的促能量代謝作用

陳遠(yuǎn)云，王露莎，榮向路,3,4 ，郭姣,3,4

(1.廣東省代謝病中西醫(yī)結(jié)合研究中心， 廣東 廣州510006； 2.廣東省代謝性疾病中醫(yī)藥防治重點實驗室，廣東 廣州510006； 3.國家中醫(yī)藥管理局脂代謝國家中醫(yī)藥三級實驗室，廣東 廣州 510006； 4.國家中醫(yī)藥管理局高脂血癥調(diào)肝降脂國家中醫(yī)藥重點研究室，廣東 廣州510006)

正常情況下，人體內(nèi)物質(zhì)能量代謝處于動態(tài)平衡中。當(dāng)能量代謝發(fā)生障礙時，體內(nèi)的這種平衡就會被破壞，從而引起相關(guān)疾病的發(fā)生[1-4]。在疾病治療的過程中，一般講究對癥下藥，如治療糖尿病、高脂血癥時，一般都會根據(jù)降糖、降脂這些特點來選擇用藥。因此在進(jìn)行基礎(chǔ)研究中，更多的是偏于物質(zhì)代謝途徑，然而卻忽略了能量代謝異常也是疾病發(fā)生的一個主要原因。目前，許多學(xué)者的關(guān)注點已經(jīng)從物質(zhì)代謝途徑轉(zhuǎn)向能量代謝途徑，以此作為切入點對疾病進(jìn)行研究，得到了一定成果[5-8]。

復(fù)方貞術(shù)調(diào)脂方(Fufang Zhenzhu Tiaozhi Formula,FTZ)由女貞子、黃連、佛手、三七等八味中藥組成，是廣東藥科大學(xué)郭姣教授調(diào)肝啟樞化濁創(chuàng)新理論的代表驗，對高脂血癥[9-10]、糖尿病、動脈粥樣硬化[11-12]、非酒精性脂肪肝[13-16]等糖脂代謝紊亂疾病療效顯著。FTZ以往研究中，主要集中于糖代謝、脂代謝等物質(zhì)代謝途徑，未有相關(guān)能量代謝方面的報道。本研究從能量代謝的角度出發(fā)，使用aP2-SREBP1c轉(zhuǎn)基因小鼠、正常C57小鼠及鹽酸氯丙嗪低溫模型小鼠這3種模型，來觀察不同情況下FTZ在能量代謝方面的作用，為糖脂代謝疾病的治療提供思路。

1 材料

1.1 實驗動物

8周齡aP2-SREBP1c轉(zhuǎn)基因小鼠，雄性，SPF級，美國Jackson實驗室引進(jìn)，委托南京大學(xué)模式動物研究所凈化，然后轉(zhuǎn)至廣東藥科大學(xué)動物中心飼養(yǎng)繁殖，動物合格證號：J003393 SCXK(蘇)2010-0001。8周齡C57BL/6J小鼠，雄性，SPF級，由廣東省醫(yī)學(xué)實驗動物中心提供，生產(chǎn)許可證號：SCXK(粵)2013-0002。所有小鼠均適應(yīng)性飼養(yǎng)7 d后進(jìn)行實驗。

1.2 藥品與試劑

FTZ浸膏粉(FTZ，批號：20160901)為廣東藥科大學(xué)第一附屬醫(yī)院院內(nèi)制劑(批準(zhǔn)文號：粵制藥字Z20110029)，臨床應(yīng)用多年；氯丙嗪鹽酸鹽(梯希愛上?；晒I(yè)發(fā)展有限公司，貨號69-09-0，質(zhì)量分?jǐn)?shù)98.0%)；生理鹽水(廣東利泰制藥股份有限公司，批號：5216040605)。XF細(xì)胞線粒體壓力測試試劑盒(安捷倫科技有限公司，貨號：103015-100)

1.3 主要儀器

XFe24細(xì)胞能量代謝分析儀(安捷倫科技有限公司)；MP150小鼠生理活動儀電子體溫計系統(tǒng)(普升科技有限公司)；實驗動物綜合監(jiān)測系統(tǒng)(Columbus Instruments， USA)；SHP-150生化培養(yǎng)箱(上海精宏實驗設(shè)備有限公司)；5180R型低溫高速離心機(Eppendorf，美國)；ELGA超純水機(威立雅水處理技術(shù)有限公司)。

2 方法

2.1 使用模型

aP2-SREBP1c脂肪代謝障礙模型小鼠: aP2-SREBP1c轉(zhuǎn)基因小鼠，是由于脂肪組織內(nèi)特異性aP2的啟動子的控制下固醇元件結(jié)合蛋白-1c(SREBP-1c)的過表達(dá)小鼠模型，具有明顯的脂質(zhì)代謝紊亂和脂肪生成分化障礙的特點，曾用于糖尿病的研究[17]。

正常小鼠：C57BL/6j小鼠，SPF級，8周齡。用于探究FTZ對正常小鼠的能量代謝作用。

鹽酸氯丙嗪低溫小鼠模型的制備：以水為溶劑，配制0.08%鹽酸氯丙嗪溶液，造模時給小鼠腹腔注射0.08%鹽酸氯丙嗪溶液，注射容積為0.1 mL/10 g體質(zhì)量，腹腔注射后小鼠體溫顯著下降[18]。

2.2 分組與給藥

aP2-SREBP1c脂肪代謝障礙模型小鼠實驗組:小鼠根據(jù)基因型分為同窩野生型小鼠、aP2-SREBP1c轉(zhuǎn)基因小鼠。同窩野生型小鼠為野生對照組(WT)，aP2-SREBP1c脂肪代謝障礙小鼠分為模型組(MO)、陽性藥二甲雙胍組(R)、FTZ高劑量組(FH)、FTZ中劑量組(FM)和FTZ低劑量組(FL)，每組12只。野生對照組、模型組給予蒸餾水，陽性藥二甲雙胍組給予250 mg/kg二甲雙胍， FTZ高劑量組給予2.4 g/kg FTZ浸膏粉，F(xiàn)TZ中劑量組給予1.2 g/kg FTZ浸膏粉，F(xiàn)TZ低劑量組給予0.6 g/kg FTZ浸膏粉，共給藥12周。給藥結(jié)束后，提取其棕色脂肪組織SVF細(xì)胞進(jìn)行棕色脂肪細(xì)胞線粒體耗氧量實驗 。

C57正常小鼠實驗組:將小鼠分為對照組和給藥組，每組10只?？瞻讓φ战M給予蒸餾水；給藥組給予1.2 g/kg FTZ，共給藥14 d。各組小鼠分為兩部分，一部分用于肛溫測定；另一部分于給藥的最后1天放入實驗動物監(jiān)測系統(tǒng)中監(jiān)測小鼠給藥后的能量代謝情況。

氯丙嗪低溫小鼠實驗組:將小鼠分為3組，分別為對照組、模型組與給藥組，每組10只?？瞻讓φ战M與模型組給予蒸餾水；給藥組給予1.2 g/kg FTZ浸膏粉，共給藥14 d。給藥最后1天，模型組小鼠與給藥組小鼠按照 0.1 mL/10 g體質(zhì)量腹腔注射0.08%鹽酸氯丙嗪溶液，空白組小鼠按照0.1 mL/10 g體質(zhì)量腹腔注射生理鹽水。各組小鼠分為兩部分，一部分用于肛溫測定，分別測小鼠腹腔注射0.08%鹽酸氯丙嗪溶液后0 min、15 min、30 min、45 min、60 min、1.5 h、3.0 h、4.0 h、6.0 h、8.0 h、30.0 h的肛溫；另一部分小鼠置于實驗動物監(jiān)測系統(tǒng)，用于能量代謝的測定。

2.3 肛溫測定方法

連接好MP150小鼠生理活動儀中的電子溫度計系統(tǒng)模塊，將小鼠放入小鼠固定器中，待其稍安靜，用甘油潤滑溫度探頭，將溫度探頭插入小鼠肛門，固定插入一定位置不動，待體溫讀數(shù)穩(wěn)定后，記錄數(shù)據(jù)。正式實驗前3天每天測1次肛溫，讓小鼠適應(yīng)溫度探頭的刺激。

C57正常小鼠實驗組:從給藥第1天開始，分別于給藥后0 min、1.5 h和3 h測小鼠肛溫，每隔3天測1次，對比給藥后3 h小鼠體內(nèi)肛溫變化的情況。

氯丙嗪低溫小鼠實驗組:分別測小鼠腹腔注射0.08%鹽酸氯丙嗪溶液后0 min、15 min、30 min、45 min、60 min、1.5 h、3.0 h、4.0 h、6.0 h、8.0 h、30.0 h的肛溫。對比各組小鼠肛溫變化的情況。

2.4 實驗動物監(jiān)測系統(tǒng)監(jiān)測小鼠能量代謝情況

C57正常小鼠實驗組：安裝好儀器，加入水和飼料，將小鼠放入代謝籠中馬上進(jìn)行氣體校正，開始對小鼠的能量代謝情況進(jìn)行為期3 d的監(jiān)測。取中間一個晝夜的結(jié)果進(jìn)行分析。

氯丙嗪低溫小鼠實驗組：安裝好儀器，進(jìn)行儀器氣體校正后，提前將小鼠放入代謝籠中適應(yīng)1 d，第2天腹腔注射0.08%氯丙嗪后，馬上開始對小鼠進(jìn)行24 h的能量代謝情況的監(jiān)測。

2.5 棕色脂肪細(xì)胞線粒體耗氧量實驗

aP2-SREBP1c脂肪代謝障礙模型小鼠棕色脂肪組織SVF細(xì)胞的提?。航o藥結(jié)束后，取適量棕色脂肪組織，加入組織體積10倍左右的2%BSA的2 mg/mLⅠ型膠原酶。剪碎，放于37 ℃中孵育30 min左右，取出，過100 μm細(xì)胞濾器，用PBS清洗1～2次，混合濾液，過濾，1 000 g離心5 min；取出，吸去上次脂滴，然后倒去上清；加入3～5 mL 含有10%FBS 1%雙抗的完全培養(yǎng)基，吹散，過40 μm細(xì)胞濾器；1 000g離心5 min，倒去上清，加入10%FBS 1%雙抗的完全培養(yǎng)基，種板；于37 ℃，5%(φ) CO2培養(yǎng)箱進(jìn)行培養(yǎng)。

線粒體耗氧量實驗前1天，將細(xì)胞接種到細(xì)胞培養(yǎng)板中，在生長培養(yǎng)基中過夜培養(yǎng)；并打開儀器，過夜預(yù)熱；在固定板中加入校準(zhǔn)液，將測試板放回固定板上，置于37 ℃ 無CO2培養(yǎng)箱中過夜水化探針。

線粒體耗氧量實驗當(dāng)天，用專業(yè)的基礎(chǔ)營養(yǎng)液配制檢測液，加入所需要的底物，將溶液加熱至37 ℃ ，調(diào)pH值至7.4，過濾，置37 ℃ 水浴中備用；在顯微鏡下觀察細(xì)胞狀態(tài)良好，將生長培養(yǎng)基換為檢測液，然后將細(xì)胞放置在37 ℃ 無CO2培養(yǎng)箱中1 h；將稀釋好的藥物分別加入測試板上的A、B、C、D 4個加藥孔中，放入細(xì)胞能量代謝分析儀中進(jìn)行檢測。

2.6 統(tǒng)計學(xué)處理

3 結(jié)果

3.1 FTZ對aP2-SREBP1c脂肪代謝障礙模型小鼠耗氧量的影響

結(jié)果見圖1。線粒體是機體重要的產(chǎn)能器官，主要通過呼吸作用來產(chǎn)生能量。通過線粒體耗氧情況可以反映出機體能量代謝情況。線粒體耗氧量曲線中的第一階段(第1時間點至第3時間點)代表細(xì)胞的基礎(chǔ)耗氧量，反映質(zhì)子通過呼吸鏈形成電勢后，轉(zhuǎn)化為ATP合成所需能量和熱量的情況。從圖1A可以得知，模型組小鼠棕色脂肪細(xì)胞線粒體基礎(chǔ)耗氧量與同窩野生型小鼠相似，給予高、低劑量的FTZ治療后，模型組小鼠的細(xì)胞基礎(chǔ)耗氧量未出現(xiàn)變化，而在給予二甲雙胍與中劑量FTZ時，模型組小鼠基礎(chǔ)耗氧量升高，說明中劑量FTZ可促進(jìn)線粒體中ATP的合成和產(chǎn)熱的發(fā)生。線粒體耗氧量曲線中第3階段(第7個至第9個時間點)是加入線粒體氧化磷酸化解偶聯(lián)劑(FCCP)之后檢測的數(shù)值，在FCCP的作用下，大量質(zhì)子回流，導(dǎo)致耗氧增加，此階段的數(shù)值代表線粒體的最大耗氧能力，可間接顯示細(xì)胞的最大的呼吸能力。各組小鼠在此階段均表現(xiàn)不同的差異，其中升高最明顯的是二甲雙胍組和中劑量FTZ組。故對第3階段的最大耗氧量結(jié)果進(jìn)行定量分析(圖B)，結(jié)果顯示模型小鼠的最大耗氧能力與正常組小鼠相比顯著降低，而在給予高、中、低劑量的FTZ治療后，小鼠皮下脂肪組織SVF細(xì)胞的耗氧量均有不同程度增加，且中劑量組和低劑量組與模型組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。提示FTZ能夠增強棕色脂肪SVF細(xì)胞線粒體的呼吸率，增加機體能量代謝。

aP2-SREBP1c脂肪萎縮小鼠具有高血糖、高血脂、胰島素抵抗等特點[17-20]，其體內(nèi)的物質(zhì)代謝水平，包括糖代謝、脂代謝均出現(xiàn)異常。而本實驗通過棕色脂肪組織線粒體耗氧量實驗證明了該模型小鼠也具有能量代謝異常的特點，而經(jīng)過FTZ治療后，其能量代謝水平升高了，說明FTZ不僅能改善糖脂代謝疾病中的物質(zhì)代謝紊亂，還能提高其能量代謝。

A.棕色脂肪組織SVF細(xì)胞線粒體耗氧量曲線； B.棕色脂肪組織SVF細(xì)胞線粒體耗氧量。與野生對照組比較：#P<0.05；與模型組比較：*P<0.05，**P<0.01。

圖1FTZ對aP2-SREBP1c脂肪代謝障礙模型小鼠棕色脂肪細(xì)胞呼吸率的影響

Figure1Effect of FTZ on mitochondrial respiratory rate of brown adipose tissue in aP2-SREBP1c lipodystrophy mice

3.2 FTZ對C57正常小鼠中心體溫的影響

給藥前后3.0 h 內(nèi)肛溫變化的結(jié)果顯示見圖2，給藥前5天，對照組小鼠給藥后的波動幅度逐漸升高，給藥5 d后相對穩(wěn)定不變。而給藥組小鼠下降給藥14 d后，肛溫的波動幅度降低。與對照組相比，剛開始給藥時FM組小鼠體溫下降幅度更大，而在給藥14 d后，F(xiàn)M 組小鼠肛溫下降幅度降低，幾乎無明顯改變。小鼠肛溫的變化可以反映小鼠體內(nèi)中心體溫的情況。說明FTZ可以抵抗短時間的外界刺激，減少中心體溫的波動。

給藥14 d后，正常組小鼠與給藥組小鼠的肛溫?zé)o明顯變化(見圖3)。以上結(jié)果說明，給藥FTZ 2周不影響正常小鼠的中心體溫。

3.3 FTZ對C57正常小鼠能量代謝的影響

結(jié)果見圖4。小鼠耗氧量代表小鼠利用氧氣進(jìn)行有氧呼吸的能力，間接反映機體的能量代謝的強弱。給藥14 d后，F(xiàn)TZ組小鼠夜間呼吸商相對于對照組顯著升高，白天呼吸商無明顯變化(圖4B)，提示FTZ可以增加正常小鼠的夜間的代謝活性。然而對照組小鼠與FTZ組小鼠的耗氧量、熱量值結(jié)果均未顯示出差異(圖4A、C)，說明FTZ并不能增加C57正常小鼠的能量支出。綜上可知，短期給藥FTZ并不能增強正常小鼠的能量代謝。

3.4 FTZ對氯丙嗪誘導(dǎo)的低溫小鼠中心體溫的影響

如圖5A結(jié)果所示，鹽酸氯丙嗪能顯著降低小鼠的體溫，并于30 h 后恢復(fù)正常體溫。

注射氯丙嗪藥物后，F(xiàn)TZ 組整體體溫曲線均高于氯丙嗪對照組，且FTZ組能緩解注射0.08%鹽酸氯丙嗪溶液后15 min、30 min體溫降低的情況，其肛溫變化明顯比氯丙嗪對照組小(見圖5B)，且差異有統(tǒng)計學(xué)意義。但其不能改善注射后45 min 后的體溫降低現(xiàn)象。說明FTZ只能短暫緩解小鼠體內(nèi)由于氯丙嗪引起的低溫，但無法逆轉(zhuǎn)這個降溫現(xiàn)象。

3.5 FTZ對氯丙嗪誘導(dǎo)的低溫小鼠能量代謝的影響

如圖6結(jié)果所示，鹽酸氯丙嗪能顯著降低小鼠24 h內(nèi)的耗氧量，并使熱量值顯示下降的趨勢。提示鹽酸氯丙嗪能降低小鼠24 h內(nèi)的能量代謝。與模型組相比，F(xiàn)TZ組小鼠耗氧量有升高的趨勢，但差異無統(tǒng)計學(xué)意義。說明，F(xiàn)TZ并不能長時間維持對氯丙嗪低溫小鼠能量代謝的促進(jìn)作用。

圖2各時間段小鼠體溫波動曲線圖

Figure2Curve of body temperature fluctuation of mice in each time period

圖3FTZ給藥2周后小鼠的肛溫變化曲線

Figure3Anal temperature curve of mice after two weeks of FTZ administration

A.耗氧量; B.呼吸商; C.熱量值。與對照組比較:*P<0.05。

圖4FTZ給藥2周后小鼠的能量代謝情況

Figure4Energy metabolism of mice after two weeks of FTZ administration

A.注射鹽酸氯丙嗪后小鼠8 h肛溫曲線圖； B.注射鹽酸氯丙嗪后8 h 的小鼠肛溫變化； 與模型組比較：*P<0.05,**P<0.01。

圖5FTZ對鹽酸氯丙嗪低溫模型小鼠中心體溫的影響
Figure5Effect of FTZ on central body temperature of mice with chlorpromazine hypothermia

與對照組比較:*P<0.05。

圖6注射鹽酸氯丙嗪后小鼠 24 h 內(nèi)的能量代謝情況
Figure6Energy metabolism of mice within 24 hours after injection of chlorpromazine hydrochloride

如圖7所示，對鹽酸氯丙嗪實驗結(jié)果進(jìn)一步分析，發(fā)現(xiàn)模型組小鼠在腹腔注射鹽酸氯丙嗪后的24 h內(nèi)，模型組與給藥組小鼠的呼吸商差異無統(tǒng)計學(xué)意義，而其耗氧量、熱量值均顯著下降。說明鹽酸氯丙嗪可使小鼠的能量代謝下降。造模5 h后，給藥組與模型組的耗氧量(圖7A)、熱量值(圖7B)開始顯示出統(tǒng)計學(xué)差異，且差異在變大。造模12～16 h時，給藥組與模型組的能量代謝指標(biāo)顯示出最大差異。以上結(jié)果說明，F(xiàn)TZ并不能長時間維持對氯丙嗪低溫小鼠能量代謝的促進(jìn)作用，其藥效在鹽酸氯丙嗪造模的第12～16小時之間達(dá)到最佳。提示FTZ能改善這種由于鹽酸氯丙嗪導(dǎo)致的低耗氧量、低熱量值的情況，具有促進(jìn)小鼠能量代謝的作用。

上述結(jié)果表明，鹽酸氯丙嗪能顯著降低小鼠的體溫、降低小鼠的能量代謝，并于30 h后恢復(fù)正常體溫； FTZ 短期給藥，不能提高正常小鼠的體溫，但有減少給藥后的體溫波動的趨勢。FTZ能升高由鹽酸氯丙嗪誘導(dǎo)的低溫小鼠的1 h內(nèi)體溫，促進(jìn)其24 h內(nèi)的能量代謝。

A. FTZ對鹽酸氯丙嗪模型小鼠各時間點耗氧量的影響；

B. FTZ對鹽酸氯丙嗪模型小鼠各時間點熱量值的影響；

C. FTZ對鹽酸氯丙嗪模型小鼠各時間點呼吸商的影響。

與對照組比較：*P<0.05,**P<0.01；與模型組比較：#P<0.05,##P<0.01。

圖7注射鹽酸氯丙嗪24 h內(nèi)小鼠各時間點的能量代謝情況

Figure7Energy metabolism of mice injected with chlorpromazine hydrochloride at various time points within 24 hours

4 討論

本實驗中分別采取了3種小鼠模型，分別為aP2-SREBP1c脂肪代謝障礙模型小鼠、C57正常小鼠、氯丙嗪誘導(dǎo)的低溫小鼠。研究表明，aP2-SREBP1c脂肪代謝障礙小鼠具有高血糖癥、高胰島素血癥、胰島素抵抗和2型糖尿病等病理表征[19-21]，具有顯著糖脂代謝紊亂的特點。前期研究表明，F(xiàn)TZ可以改善aP2-SREBP1c脂肪代謝障礙模型小鼠的糖脂代謝紊亂[22-23]。本研究從能量代謝角度對其進(jìn)行研究，希望能從中找到FTZ治療糖脂代謝疾病相關(guān)機制的更多可能性。結(jié)果表明， aP2-SREBP1c脂肪代謝障礙模型小鼠的棕色脂肪組織耗氧量與對照組相比顯著下降，說明該模型小鼠既存在糖、脂代謝紊亂，同時也存在能量代謝障礙，給予FTZ治療后，模型小鼠棕色脂肪組織耗氧量顯著升高，說明FTZ能促進(jìn)糖脂代謝紊亂下的能量代謝。

在正常C57小鼠實驗中，給藥FTZ 14 d，小鼠的晚間呼吸商相對于對照組顯著升高，而小鼠的中心體溫及其他能量代謝指標(biāo)并無顯著變化，說明短期給藥FTZ只能促進(jìn)正常小鼠晚間的代謝活性，對正常小鼠的整體能量代謝無太大影響。

鹽酸氯丙嗪為中樞多巴胺受體的阻斷劑，通過阻斷中腦-邊緣葉及中腦-皮質(zhì)通路中的多巴胺受體而產(chǎn)生鎮(zhèn)靜效應(yīng)。研究表明，氯丙嗪對下丘腦體溫調(diào)節(jié)中樞有很強的抑制作用，使體溫調(diào)節(jié)中樞喪失調(diào)節(jié)體溫的作用[24-26]，臨床常用于低溫麻醉、人工冬眠。本實驗采用氯丙嗪誘導(dǎo)的低溫小鼠模型，主要探究FTZ在非糖脂代謝紊亂情況下對能量代謝的作用。實驗證明，腹腔注射0.08%鹽酸氯丙嗪能顯著降低小鼠的體溫與機體的能量代謝，持續(xù)時長約24 h。而在給予FTZ的情況下，不僅能短暫緩解由于氯丙嗪引起的低溫，同時還能升高其能量代謝。以上結(jié)果證明，F(xiàn)TZ不能改變正常狀態(tài)下的機體的能量代謝狀態(tài)，但可以促進(jìn)非糖脂代謝紊亂情況下的能量代謝。

“調(diào)肝啟樞化濁”，是基于糖脂代謝疾病一體化綜合防控而提出的一種策略[27]，強調(diào)糖脂代謝紊亂性疾病的本質(zhì)就是“濁”，運用多種有效手段，從多個環(huán)節(jié)干預(yù)，通過“調(diào)肝”使全身氣機通暢，五臟安和；“啟樞”使脾胃升降有序，運化功能正常，從而達(dá)到防治未病的效果。就是通過多種有效手段，使機體的功能恢復(fù)正常。本研究證明了FTZ在非糖脂代謝依賴下的促能量代謝作用，符合糖脂代謝疾病一體化綜合防控的策略要求，為FTZ治療糖脂代謝紊亂的潛在機制研究提供了更多的可能。