市售菟絲子飲片指紋圖譜研究

潘杰，林秀蓮，毋福海，李華，林錦峰

(廣東藥科大學1.藥學院； 2.中藥學院； 3.公共衛(wèi)生學院，廣東 廣州 510006； 4.廣東省藥品檢驗所，廣東 廣州 510180)

菟絲子別名吐絲子，始載于《神農本草經》，列為上品。2015年版《中國藥典》收載的品種為旋花科植物南方菟絲子CuscutaaustralisR.Br.或菟絲子CuscutachinensisLam.的干燥成熟種子。菟絲子具有補益肝腎、固精縮尿、安胎、明目、止瀉的功效，臨床上用于肝腎不足、腰膝酸軟、陽痿遺精、腎虛胎漏等[1]。菟絲子主要含黃酮類、酚酸類、生物堿類、氨基酸及微量元素等成分[2-4]，具有免疫調節(jié)、抗衰老、抗氧化、保肝、促性腺激素樣等多種藥理作用[5]。

目前，《中國藥典》采用薄層色譜和單一成分含量測定等方法評價菟絲子的質量，亦有其他成分(綠原酸、異槲皮苷、槲皮素、紫云英苷等)含量測定和HPLC指紋圖譜研究報道[6-9]。隨著菟絲子市場需求連年增加，藥材價格持續(xù)上漲，市面上出現了許多假冒菟絲子，如摻入偽品與混淆品日本菟絲子、紫蘇子，雜質泥沙、雜草種子等[10]，導致藥材質量參差不齊。本研究采用UPLC指紋圖譜法對全國各地的102個生產廠家112批次市售菟絲子飲片進行快速分析，并運用相似度分析、聚類分析和主成分分析對菟絲子的指紋圖譜進行比較，考察市售菟絲子飲片質量一致性狀況，為其質量評價提供參考。

1 儀器與試藥

島津Nexera LC-30A超高效液相色譜儀(包括LC30-AD二元梯度泵，SIL-30AC進樣器，SPD-M30A PDA檢測器，CTO-20AC柱溫箱)；Sartorius CP224S(萬分之一)、CP225D(十萬分之一)電子天平；KQ-300DE超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司)；Milli-Q超純水機(Millipore)。乙腈(色譜純，美國Honeywell公司)；甲醇、甲酸(分析純，廣州化學試劑廠)。

對照品綠原酸(批號110753-201415，質量分數96.2%)、金絲桃苷(批號111521-201507，質量分數94.3%)、異槲皮苷(批號 111809-201403，質量分數92.9%)、山柰素(批號110861-201310，質量分數95.5%)均購自中國食品藥品檢定研究院；紫云英苷(批號 480104，質量分數98.0%)購自上海安譜實驗科技股份有限公司。

菟絲子，共計102個生產廠家112批次樣品，廠家覆蓋安徽、北京、甘肅、廣東、廣西、海南、河北、河南、湖北、湖南、江蘇、江西、青海、山東、山西、陜西、上海、四川、天津、云南、浙江、重慶22個省、市、區(qū)，見表 1。

2 方法與結果

2.1 色譜條件

色譜柱：Agilent SB-C18(2.1 mm×100 mm，1.8 μm)；流動相：以乙腈(A)-質量分數0.2%甲酸水溶液(B)進行梯度洗脫(0～4 min，7%～9%A；8～11 min，13%A；11～18 min，13%～14%A；18～24 min，14%～30%A；24～30min，30%～31%A)；流速：0.4 mL/min；柱溫：35 ℃；檢測波長：采用切換法(1～5 min，325 nm；5～12 min，260 nm；12～30 min，360 nm)；進樣量：2 μL。

2.2 溶液的制備

2.2.1 供試品溶液制備 取菟絲子粉末(過二號篩)約1 g，精密稱定，置50 mL量瓶中，加體積分數80%甲醇40 mL，超聲處理(功率500 W，頻率40 kHz)1 h，放冷，加體積分數80%甲醇至刻度，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，即得。

2.2.2 混合對照品溶液制備 稱取綠原酸、金絲桃苷、異槲皮苷、紫云英苷和山柰酚對照品適量，精密稱定，置于同一量瓶中，加甲醇制成每1 mL含綠原酸25.01 μg、金絲桃苷28.29 μg、異槲皮苷22.57 μg、紫云英苷21.62 μg、山柰酚21.65 μg的混合對照溶液，即得。

2.3 方法學考察

2.3.1 精密度試驗 取同一供試品溶液(批號160201)，按“2.1”項下的色譜條件連續(xù)進樣6次，以7號峰為參照，測得10個共有峰的相對保留時間的RSD均小于1.2%，相對峰面積的RSD均小于3.0%，各色譜圖的相似度值不低于0.98，表明儀器穩(wěn)定、儀器精密度良好。

2.3.2 重復性試驗 取同一批樣品(批號160201)，平行制備6份供試品溶液，按“2.1”項下的色譜條件測定，以7號峰為參照，測得10個共有峰的相對保留時間的RSD均小于1.0%，相對峰面積的RSD均小于3.0%，各色譜圖的相似度值為1.00，表明方法重復性良好。

2.3.3 穩(wěn)定性試驗 取同一供試品溶液(批號160201)，按“2.1”項下的色譜條件分別于0、2、4、8、12、24 h測定，以7號峰為參照，測得10個共有峰的相對保留時間的RSD均小于1.7%，相對峰面積的RSD均小于3.0%，各色譜圖的相似度值為1.00，表明供試品溶液在24 h內穩(wěn)定。

表1 112批次菟絲子飲片的信息Table 1 Information of 112 batches CS samples

注：序號中的同一字母代表同一企業(yè)的不同批次。

2.4 對照指紋圖譜的建立及相似度計算

將112批次市售菟絲子樣品制備成供試品溶液，各取2 μL，按“2.1”項下色譜條件進行測定，記錄色譜圖(圖1)。選取雜質少的22批樣品圖譜導入“中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統2012A版(國家藥典委員會)”生成對照圖譜，對0～30 min內的峰進行分析，選擇分離度高，重復性好的色譜峰作為共有指紋峰，共標定10個共有峰，并指認其中5個色譜峰，分別為綠原酸(2號峰)、金絲桃苷(7號峰)、異槲皮苷(8號峰)、紫云英苷(9號峰)、山柰酚(10號峰)。將余下的90批樣品圖譜導入“中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統2012A 版(國家藥典委員會)”，計算它們與對照圖譜的相似度，其中11批樣品相似度范圍在0.659～0.930之間，其余79批樣品相似度均在0.950以上，結果見表2、圖2。同時以篩選所得的10個共有峰面積為變量，應用SPSS 22分析軟件進行聚類分析，聚類結果見圖3。

結合112批菟絲子樣品的UPLC指紋圖譜疊加圖、相似度分析結果和聚類分析，可以發(fā)現樣品5a、23、46、47、65、94、99、100、104、106、112與其他樣品差異較為明顯，相似度均小于0.930，其他101批樣品聚為一類，且相似度均在0.950以上，故剔除這11個樣品不作主成分分析和質量綜合評價。

2.綠原酸；7.金絲桃苷；8.異槲皮苷；9.紫云英苷；10.山柰素。
圖1菟絲子指紋圖譜(A)及混合對照品色譜圖(B)

Figure1The fingerprint of CS (A) and the chromatogram of reference substances (B)

表2 112批菟絲子飲片UPLC 指紋圖譜相似度評價結果Table 2 Similarities of 112 batches of CS UPLC fingerprints

圖2 112批菟絲子飲片 UPLC 指紋圖譜Figure 2 TUPLC fingerprints of 112 batches of CS samples

圖3112批菟絲子飲片聚類分析(CA)樹狀圖

Figure3CA dendrogram of 112 batches of CS samples

2.5 主成分分析

將通過相似度分析和聚類分析得到的相似度在0.950以上且聚為一類的101批次市售菟絲子樣品進行主成分分析。采用SPSS 22.0軟件，以10個共有峰面積原始值為變量，計算主成分特征值、累計貢獻率并計算主成分綜合得分，對市售101批次菟絲子進行質量評價。由表3可知，菟絲子主成分分析中前3個主成分的特征值均大于1，累計方差貢獻率81.698%，故取前3個為主成分，其中特征值λ1=4.777，λ2=1.861，λ3=1.532，其他均小于1；特征值λ1的貢獻率為47.772%，λ2的貢獻率為18.605%，λ3的貢獻率為15.321。

由表4可知，第1主成分主要反映了綠原酸、異槲皮苷、金絲桃苷和1、5、6號色譜峰信息，第2主成分主要反映了1、3、4號色譜峰信息；第3主成分主要反映了1、3、4號色譜峰信息。

表5為因子得分系數矩陣，由此可得到最終的因子得分公式：F1=0.256 × 峰1峰面積+0.012 × 綠原酸峰面積+...+0.102 × 山柰酚峰面積；F2=-0.002 × 峰1峰面積 +0.328 × 綠原酸峰面積+...+(-0.108×山柰酚峰面積；F3=0.128×峰1峰面積+0.050×綠原酸峰面積+...+0.404×山柰酚峰面積。采用方差貢獻率作為取值，3個旋轉后的公因子的方差貢獻率分別為37.759%、23.538%、20.402%，所以，各樣品的綜合得分的公式為：zF=37.759%×F1+23.538%×F2+20.402%×F3，最終計算各菟絲子樣品綜合評價值和排名，其中浙江、廣東、河南、北京、甘肅5個生產地具有較高的平均綜合得分。

表3 菟絲子主成分特征值和貢獻率Table 3 Variance of total variance interpretation of CS

表4 菟絲子主成分的載荷矩陣Table 4 Composition matrix of CS

表5 菟絲子主成分因子的得分系數矩陣Table 5 Composition score coefficient matrix of CS

3 討論

本研究對樣品前處理方法和UPLC指紋圖譜色譜條件進行了優(yōu)化。菟絲子主要含黃酮類、酚酸類、氨基酸及微量元素等，黃酮類化合物是其主要有效成分，根據主要成分的結構和性質，分別以不同比例的甲醇-水為提取溶劑進行考察，分別比較提取成分的種類以及菟絲子中綠原酸、金絲桃苷、異槲皮苷、紫云英苷和山柰酚的總提取率，結果表明80%的甲醇總提取率最高，因此選擇80%的甲醇作為提取溶劑。對加熱回流和超聲提取2種方式進行考察，結果表明加熱回流與超聲提取2種方式提取率相當，為操作簡便，本研究采用超聲提取的方式。對不同提取時間(20、40、60、80 min)進行考察，結果表明60 min與80 min的提取率相當，為節(jié)省時間，選擇超聲提取60 min。在色譜柱的選用上，考察了3種色譜柱：Waters ACQUITYTMBEH C18(2.1 mm×100 mm，1.7 μm)、Agilent SB-C18(2.1 mm×100 mm，1.8 μm)、InertSustainSwiftTMC18(2.1 mm×100 mm，1.9 μm)，結果表明3種色譜柱均能較好的分離樣品，得到較好的峰形和分離度，選用了Agilent SB-C18(2.1 mm×100 mm，1.8 μm)。對檢測波長進行了考察，采用二極管陣列檢測器記錄200～400 nm的紫外吸收光譜圖，結果顯示在0～5 min和325 nm、5～12 min和260 nm、12～30 min和360 nm下，色譜峰數多且峰面積大，因此選擇波長切換法進行檢測。

本研究以2015年版《中國藥典》為基礎，建立了菟絲子的UPLC指紋圖譜，標定共有峰10個。將建立的指紋圖譜應用于102個生產廠家112批次菟絲子飲片的質量評價，通過相似度計算，發(fā)現大部分廠家生產的菟絲子質量一致性較好，也有部分存在一定差異。UPLC指紋圖譜可以更快速、全面表征不同廠家藥品的質量信息，較常規(guī)檢驗和單一成分定量測定，更能全面反映菟絲子質量的一致性和穩(wěn)定性，對菟絲子的質量比較與評價有更積極的意義。