銀-銅/還原氧化石墨烯修飾的玻碳電極測(cè)定當(dāng)歸中的阿魏酸

葉鴻清，賴木深，朱明芳，梁煥如，梁學(xué)彬

(廣東藥科大學(xué)藥學(xué)院，廣東 廣州 510006)

阿魏酸即3-甲氧基-4-羥基肉桂酸，具有抗菌、抗腫瘤、抗氧化、抗紫外線輻射、抗自由基和人體免疫系統(tǒng)調(diào)節(jié)等藥理活性，在疾病預(yù)防和治療中起著重要的作用[1-3]。目前，阿魏酸在臨床上主要用于治療冠心病、腦血管阻塞、血管炎以及白細(xì)胞和血小板減少等疾病，另外在保健食品、化妝品和營養(yǎng)補(bǔ)充劑中也有重要應(yīng)用[4]。常用的阿魏酸測(cè)定方法包括薄層色譜法[5]、高效液相色譜法[6]、毛細(xì)管電泳法[7]、熒光分光光度法[8]、電化學(xué)測(cè)定法[9-10]等。電化學(xué)方法因具有高靈敏度和低成本等優(yōu)點(diǎn)，在藥物、染料、殺蟲劑和無機(jī)物檢測(cè)上引起了極大的關(guān)注。文獻(xiàn)報(bào)道的阿魏酸電化學(xué)測(cè)定主要應(yīng)用的是其氧化峰，本課題組也曾用碳糊電極陰極溶出伏安法測(cè)定阿魏酸的氧化峰[11]。用雙金屬納米顆粒負(fù)載還原的氧化石墨烯復(fù)合材料修飾的玻碳電極測(cè)定阿魏酸的還原峰的研究未見文獻(xiàn)報(bào)道。

銀-銅雙金屬納米顆粒具有電化學(xué)催化作用，已被用于許多無酶電化學(xué)傳感器的研究中[12]。但金屬納米材料容易發(fā)生聚集，會(huì)大大降低其電化學(xué)性能，因此限制了其使用。據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，金屬納米顆粒與還原氧化石墨烯組成的復(fù)合材料，不僅具有金屬本身的性能，而且可使還原的氧化石墨烯片層間距增大，優(yōu)化了石墨烯單層的獨(dú)特性能；同時(shí)，還原氧化石墨烯和無機(jī)納米粒子能產(chǎn)生協(xié)同效應(yīng)，具有潛在應(yīng)用價(jià)值[13-15]。

本文將合成的銀-銅雙金屬/還原氧化石墨烯復(fù)合材料修飾在玻碳電極上，在0.30 V處測(cè)定阿魏酸的還原峰，建立了測(cè)定當(dāng)歸中阿魏酸的新方法。修飾的玻碳電極對(duì)阿魏酸有較好的電化學(xué)響應(yīng)，響應(yīng)快、靈敏度高，也有望用于其他中藥中阿魏酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)的測(cè)定。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

CHI1242B型電化學(xué)工作站(上海辰華儀器有限公司)；三電極系統(tǒng)：玻碳電極(直徑3 mm)及修飾電極為工作電極，鉑電極為輔助電極，飽和甘汞電極為參比電極；KQ-50E型超聲波清洗器(江蘇省昆山市超聲儀器有限公司)；pHS-25型pH計(jì)(上海智光儀器儀表有限公司)。

1.2 試藥

阿魏酸(上海阿拉丁生化科技股份有限公司，批號(hào)：1517121，質(zhì)量分?jǐn)?shù)為99%)；CuSO4·5H2O(上海阿拉丁生化科技股份有限公司)；AgNO3(上海阿拉丁生化科技股份有限公司)；氧化石墨烯(蘇州碳豐科技有限公司)；NaBH4(上海阿拉丁生化科技股份有限公司)；當(dāng)歸(廣東逢春制藥有限公司，批號(hào)分別為190201A03、190201A04、190201A05)；其他試劑均為分析純；實(shí)驗(yàn)用水為去離子水。

2 方法與結(jié)果

2.1 溶液的制備

2.1.1 對(duì)照品溶液的制備 精密稱取阿魏酸10.0 mg，用5 mL無水乙醇超聲溶解，加水定容于50 mL的容量瓶中，得到濃度為1.03 mmol/L阿魏酸對(duì)照品儲(chǔ)備液。精密移取適量?jī)?chǔ)備液，用B-R緩沖溶液(pH 5.96)稀釋，得到一系列不同濃度的阿魏酸對(duì)照品溶液。

2.1.2 供試品溶液的制備 精密稱定當(dāng)歸粉末(過三號(hào)篩)0.2 g，置于具塞錐形瓶中，加入無水乙醇20 mL，密塞、稱定質(zhì)量，于45 ℃加熱回流30 min，放冷，加入無水乙醇補(bǔ)足減少質(zhì)量，搖勻后靜置，取上清液，濾過，取續(xù)濾液即為供試品溶液。

2.2 銀-銅雙金屬/還原氧化石墨烯復(fù)合材料的合成

參考文獻(xiàn)[14]稱取CuSO4·5H2O 0.250 0 g和AgNO30.169 9 g于三頸瓶中，依次加入20 mL去離子水、10 mL氧化石墨烯水溶液(1.0 mg/mL)、10 mL檸檬酸鈉(0.02 mol/L)，加熱到25 ℃后持續(xù)攪拌反應(yīng)30 min。然后逐滴加入0.2 mol/L的NaBH4溶液20 mL，25 ℃下繼續(xù)攪拌反應(yīng)1 h。反應(yīng)完成后靜置冷卻至室溫，再用去離子水和無水乙醇清洗抽濾3次，將所得固體置于25 ℃烘箱中，直至完全干燥，所得產(chǎn)物存放在4 ℃冰箱中，備用。同法制備不含還原氧化石墨烯的銀-銅雙金屬納米顆粒。

2.3 銀-銅雙金屬/還原氧化石墨烯修飾電極的制備

將玻碳電極分別用2.5、0.5 μm Al2O3漿料拋光直至鏡面，再依次用水和乙醇超聲處理，在室溫下空氣中干燥，得到預(yù)處理的玻碳電極(GCE)。取合成的銀-銅雙金屬/還原氧化石墨烯復(fù)合材料0.5 mg于1 mLN，N-二甲基甲酰胺溶劑中，超聲溶解1 h，吸取此溶液10 μL滴涂于預(yù)處理后的玻碳電極上，所制備的修飾電極用Ag-Cu@rGO/GCE表示。同法制備銀-銅雙金屬納米顆粒修飾的玻碳電極(Ag-Cu/GCE)、還原氧化石墨烯修飾的玻碳電極(rGO/GCE)。

2.4 電化學(xué)測(cè)量方法

在pH 5.96的B-R緩沖溶液中，以自制的修飾電極為工作電極，飽和甘汞電極為參比電極，鉑電極為對(duì)電極，用差分脈沖伏安法測(cè)定阿魏酸濃度與對(duì)應(yīng)電流的線性關(guān)系，得出檢出限。同時(shí)對(duì)修飾電極進(jìn)行精密度、重復(fù)性、穩(wěn)定性、選擇性測(cè)試，最后進(jìn)行樣品測(cè)定。差分脈沖伏安法的條件為：初始電位0.1 V，終止電位0.7 V，電位增量0.01 V，脈沖幅度0.05 V，脈沖寬度0.05 s。

2.5 不同電極的電化學(xué)交流阻抗

GCE和Ag-Cu@rGO/GCE在5.0 mmol/L鐵氰化鉀溶液中的交流阻抗圖譜見圖1。

a. Ag-Cu@rGO/GCE; b.GCE。

圖1不同電極的電化學(xué)交流阻抗圖

Figure1Electrochemical AC impedance diagram of different electrodes

在阻抗圖譜中，半圓的直徑在數(shù)值上等于電極的電荷轉(zhuǎn)移電阻(Ret)[16]。由圖1可知，GCE比Ag-Cu@rGO/GCE的電阻大，說明在電極表面上修飾銀-銅雙金屬/還原氧化石墨烯復(fù)合材料能降低電極阻礙電子傳遞的能力，并提高電極的電催化性能。

2.6 差分脈沖伏安法測(cè)定當(dāng)歸中的阿魏酸

2.6.1 線性關(guān)系及檢測(cè)限 按照“2.1.1”項(xiàng)下方法分別配制濃度為1.03×10-7、4.12×10-7、6.18×10-7、1.03×10-6、2.06×10-6、6.18×10-6、8.24×10-6mol/L的阿魏酸對(duì)照品溶液，按“2.4”項(xiàng)下方法對(duì)不同濃度的阿魏酸進(jìn)行測(cè)定，結(jié)果見圖2。可見，阿魏酸的濃度在0.103～8.24 μmol/L時(shí)，峰電流隨著濃度的增大而增大，并且存在良好的線性關(guān)系，線性方程為Ipc=2.670 9c+3.434 9(其中：Ipc為峰電流，μA；c為阿魏酸濃度，μmol/L)，r=0.998 4，檢測(cè)限為0.033 μmol/L(S/N=3)

2.6.2 選擇性試驗(yàn) 按“2.1”項(xiàng)下方法配制1.03 μmol/L的阿魏酸對(duì)照品溶液，按“2.4”項(xiàng)下方法進(jìn)行干擾實(shí)驗(yàn)。結(jié)果顯示，10倍濃度的芥子酸、熊果酸、香草酸等酸性物質(zhì)對(duì)阿魏酸測(cè)定幾乎沒有干擾，50倍濃度的常見無機(jī)離子，如Mg2+、Co2+、Cu2+、K+、Mn2+、Fe3+以及SO42-，對(duì)測(cè)定幾乎無影響，說明該修飾電極對(duì)阿魏酸有良好的選擇性。

2.6.3 精密度試驗(yàn) 按“2.1.1”項(xiàng)下方法配制5.15 μmol/L的阿魏酸對(duì)照品溶液，按“2.4”項(xiàng)下方法連續(xù)測(cè)定7次，結(jié)果測(cè)得峰電流的RSD值為1.2%，表明方法精密度良好。

a～g：阿魏酸溶液濃度依次為1.03×10-7、4.12×10-7、6.18×10-7、1.03×10-6、2.06×10-6、6.18×10-6、8.24×10-6mol/L。

圖2不同濃度的阿魏酸在Ag-Cu@rGO/GCE的差分脈沖伏安圖(插入圖：阿魏酸的濃度與還原峰電流的校正曲線圖)

Figure2Differential pulse voltammogram of different concen-trations of ferulic acid in Ag-Cu@rGO/GCE (Inset: Calibration curves of ferulic acid concentration and reduction peak current)

2.6.4 重復(fù)性試驗(yàn) 按“2.1.2”項(xiàng)下方法配制供試品(批號(hào)：190201A03)溶液6份，按“2.4”項(xiàng)下方法進(jìn)行測(cè)定，結(jié)果測(cè)得阿魏酸的平均質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.782 0 mg/g，RSD值為2.2%，表明方法重復(fù)性良好。

2.6.5 穩(wěn)定性試驗(yàn) 按“2.1.2”項(xiàng)下方法配制供試品(批號(hào)：190201A03)溶液，按“2.4”項(xiàng)下方法連續(xù)5 d用差分脈沖伏安法測(cè)定，測(cè)得峰電流的RSD值為3.4%，表明方法穩(wěn)定性良好。

2.6.6 回收率試驗(yàn) 精密稱取同一批次(批號(hào)：190201A03)當(dāng)歸粉末0.2 g，共6份，分別精密加入阿魏酸對(duì)照品高、中、低3個(gè)濃度的對(duì)照品溶液，按照“2.1.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，根據(jù)“2.4”項(xiàng)下方法用Ag-Cu@rGO/GCE進(jìn)行回收率測(cè)定。

作為比較，同時(shí)采用HPLC法[17]進(jìn)行回收率測(cè)定，色譜條件如下：色譜柱為YMC-Triart C18column(250 mm×4.6 mm，5 μm)，流動(dòng)相為乙腈-5%磷酸水溶液(體積比為25∶75)，紫外檢測(cè)波長(zhǎng)為316 nm。

結(jié)果顯示，電化學(xué)法測(cè)定的平均加樣回收率為104.3%，HPLC法測(cè)得的平均加樣回收率為100.8%，且RSD均小于2%，見表1。

2.6.7 樣品分析 取3個(gè)批號(hào)當(dāng)歸樣品，按照“2.1.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，根據(jù)“2.4”項(xiàng)下方法用Ag-Cu@rGO/GCE對(duì)供試品中的阿魏酸進(jìn)行電化學(xué)測(cè)定，同時(shí)采用HPLC法[17]測(cè)定進(jìn)行比較。結(jié)果顯示，3批當(dāng)歸中阿魏酸的質(zhì)量分?jǐn)?shù)在0.773 6～0.786 4 mg/g之間，見表2。

表1 當(dāng)歸中阿魏酸的加樣回收率測(cè)定結(jié)果Table 1 Determination of the recovery of ferulic acid in Angelica sinensis (n=3)

表2當(dāng)歸中阿魏酸的質(zhì)量分?jǐn)?shù)測(cè)定結(jié)果

Table2Determination results of the content of ferulic acid inAngelicasinensis(n=3)

批次測(cè)定方法w(阿魏酸)/(mg·g-1)RSD/%190201A03Ag-Cu@rGO/GCE0.773 63.2HPLC法0.786 32.7190201A04Ag-Cu@rGO/GCE0.780 33.3HPLC法0.786 43.0190201A05Ag-Cu@rGO/GCE0.779 14.2HPLC法0.785 11.4

3 討論

3.1 化學(xué)修飾電極的選擇

本研究分別比較了阿魏酸在GCE、Ag-Cu/GCE、rGO/GCE、Ag-Cu@rGO/GCE電極上的差分脈沖伏安曲線，結(jié)果見圖3。可見，阿魏酸在Ag-Cu@rGO/GCE上的還原峰峰電流值最大，并且峰形也更好。因此，本研究選用Ag-Cu@rGO/GCE電極。

a. GCE; b.Ag-Cu/GCE; c.rGO/GCE; d.Ag-Cu@rGO/GCE。

圖31.03×10-4mol/L阿魏酸在不同電極上的差分脈沖伏安圖

Figure3Differential pulse voltamogram of 1.03×10-4mol/L ferulic acid at different electrodes

3.2 pH的選擇

本研究考察了不同pH值對(duì)阿魏酸電化學(xué)行為的影響，結(jié)果顯示，當(dāng)pH小于5.96時(shí)，峰電流隨著pH的增大不斷增大，并在pH=5.04處達(dá)到最大值，之后隨著pH的增大不斷減小。另外，在堿性的環(huán)境中阿魏酸無法獲得較好的還原峰，故選擇pH 5.96的B-R緩沖溶液為測(cè)定阿魏酸的底液。

在Ag-Cu@rGO/GCE電極上，阿魏酸的還原峰電位(Epc)與pH值成線性關(guān)系，線性方程為Epc=-0.052 8pH+0.566 8，r=0.994 1。該方程的斜率-0.052 8，接近理論值-0.059，說明阿魏酸的電化學(xué)還原反應(yīng)是等質(zhì)子等電子的反應(yīng)。

3.3 掃描速度的選擇

本研究考察了掃描速度對(duì)阿魏酸電化學(xué)行為的影響，結(jié)果顯示，隨著掃描速度的增加，還原峰峰電流也隨之增大，且電位負(fù)移；但掃描電壓過高時(shí)，充電電流過大，還原峰峰形變差，不利于峰電流的測(cè)定。在獲得較大峰電流同時(shí)又要防止充電電流過大，故選擇掃描電壓為0.1 V/s。

在Ag-Cu@rGO/GCE電極上，阿魏酸的還原峰電流(Ipc)與掃描速度(ν)的線性方程為：Ipc= -134.61ν+2.111 2(r=0.996 4)，表明阿魏酸在修飾電極表面的還原過程受吸附控制。根據(jù)Laviron方程[18]可計(jì)算轉(zhuǎn)移電子數(shù)n=1.86，說明阿魏酸在修飾電極上的電化學(xué)還原為雙電子雙質(zhì)子過程。

3.4 Ag-Cu@rGO/GCE法與HPLC法的比較

修飾電極由于具有更高的靈敏度和選擇性，在中藥成分的電化學(xué)分析中用途廣泛。本文所建立的阿魏酸電化學(xué)測(cè)定方法與HPLC法[17]比較，在回收率及質(zhì)量分?jǐn)?shù)測(cè)定結(jié)果方面的差異均不顯著，且滿足中藥成分分析的要求，表明本方法可用于當(dāng)歸中阿魏酸的測(cè)定。

本研究制備的Ag-Cu@rGO/GCE電極對(duì)阿魏酸有較好的選擇性和穩(wěn)定性，但也還存在線性范圍不夠?qū)?、檢測(cè)限不夠低等問題，在后續(xù)的研究中應(yīng)對(duì)電極進(jìn)一步優(yōu)化，改善電極的性能缺陷，以便更好地適應(yīng)中藥復(fù)雜成分中目標(biāo)物的測(cè)定。