鹽藻固體培養(yǎng)基分離純化方法的建立

王新磊，李炳乾，張?jiān)茲?，鄭秀潔，艾日肯江·庫爾班江，辛乃?/p>

(1.新疆湖鹽工程技術(shù)研究中心，新疆精河 833300；2.中鹽工程技術(shù)研究院有限公司，天津 300450)

鹽藻是鹽生杜氏藻的簡(jiǎn)稱，是一種真核藻類，可在飽和氯化鈉的極端高鹽環(huán)境下(NaCl濃度高于30%) 生長(zhǎng)[1]，在一定條件下，鹽藻體內(nèi)β-胡蘿卜素[2～3]可高達(dá)8%～10%(干重)[4]，并富含30%左右甘油和30%～40%蛋白質(zhì)以及脂肪酸、葉綠素和四烯油等，β-胡蘿卜素營(yíng)養(yǎng)價(jià)值極高，國(guó)內(nèi)外已廣泛用于醫(yī)藥、食品中[5-7]。鹽藻體內(nèi)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的積累不僅與培養(yǎng)條件有關(guān)，而且與鹽藻的品系也有很大的關(guān)系。鹽藻在養(yǎng)殖一段時(shí)間后容易老化也容易感染其他生物，因此，需要定期進(jìn)行鹽藻的分離純化才能滿足生產(chǎn)上的需要。目前，鹽藻的分離純化主要采用稀釋分離法、微細(xì)管分離法[8-11]。稀釋分離法操作比較簡(jiǎn)單，但工作量大，成功率低。微細(xì)管分離法雖然成功率高，但因鹽藻有鞭毛一直處于游動(dòng)狀態(tài)，需要相對(duì)專業(yè)的人員操作才能完成。文章發(fā)明了一種采用固體培養(yǎng)基純化分離鹽藻的方法，在實(shí)際生產(chǎn)應(yīng)用中獲得了比較好的效果。

1 材料與方法

1.1 鹽藻來源

待分離的鹽藻采自新疆精河縣精河鹽化有限責(zé)任公司鹽田儲(chǔ)鹵池。

1.2 鹽藻密度

以血細(xì)胞技術(shù)板在顯微鏡下計(jì)數(shù)。

1.3 鹽藻培養(yǎng)

篩選的鹽藻在采用Modified Johnsons Medium (J/l)[12]培養(yǎng)基，用1 000 mL三角瓶置于光照培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1.4 試驗(yàn)方法：

將一定量的瓊脂(REGULAR AGAROSE G-10)放入不同鹽度的鹽藻培養(yǎng)基中，經(jīng)過高溫滅菌后冷卻至50 ℃～70 ℃，置于恒溫水浴鍋中保持一定溫度，然后加入一定量的待分離鹽藻藻液，混勻。無菌條件下將含有鹽藻藻液的瓊脂倒入已滅菌過的培養(yǎng)皿中，冷卻后用封口膜密封。倒置于光照培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)。鹽藻由單個(gè)細(xì)胞生長(zhǎng)成細(xì)胞團(tuán)后，用鑷子或接種環(huán)挑取鏡檢，選擇純種的鹽藻培養(yǎng)。

實(shí)驗(yàn)分別從接種溫度、瓊脂濃度、培養(yǎng)基鹽度、接種鹽藻密度四個(gè)方面著手研究(表1)。

表1 試驗(yàn)項(xiàng)目及條件數(shù)據(jù)的選擇Tab.1 Selection of test items and conditional data

2 結(jié)果與分析

2.1 接種溫度的選擇

鹽藻的溫度耐受范圍比較廣，最適生長(zhǎng)溫度在25 ℃～32 ℃。試驗(yàn)對(duì)接種溫度的選擇主要是考慮到瓊脂的凝固與溫度有關(guān)。試驗(yàn)選用了35 ℃、40 ℃、45 ℃、50 ℃這四個(gè)溫度進(jìn)行接種培養(yǎng)，接種后觀察鹽藻的情況(圖1)。

從圖1可見，鹽藻接種培養(yǎng)溫度在40 ℃以下時(shí)，細(xì)胞密度快速增長(zhǎng)；接種培養(yǎng)溫度在45 ℃時(shí)，鹽藻密度變化不大，鹽藻活力降低；鹽藻接種培養(yǎng)溫度在50 ℃時(shí)，鹽藻細(xì)胞先停止運(yùn)動(dòng)后逐漸破裂死亡。因此，在選擇接種溫度時(shí)應(yīng)控制在45 ℃以下。

圖1 鹽藻在不同接種培養(yǎng)溫度下的生長(zhǎng)情況Fig.1 Growth of dunaliella salina under different inoculation and culture temperatures

2.2 瓊脂濃度的選擇

瓊脂濃度與溫度具有一定的對(duì)用關(guān)系，在一定的溫度下，瓊脂濃度越大，越容易凝固；在一定的瓊脂濃度下，溫度越低，越容易凝固。試驗(yàn)根據(jù)鹽藻的接種溫度試驗(yàn)選擇了35 ℃、40 ℃和45 ℃三個(gè)溫度用于確定對(duì)應(yīng)的瓊脂的凝固濃度(表2)。

表2 不同濃度的瓊脂在不同溫度下的狀態(tài)Tab.2 The state of agars with different concentrations at different temperatures

從表2可見在35 ℃時(shí)，試驗(yàn)用瓊脂濃度均有不同程度的凝固；40 ℃時(shí)瓊脂濃度從1.0%開始出現(xiàn)凝固現(xiàn)象；45 ℃時(shí)瓊脂濃度從1.2%開始出現(xiàn)凝固現(xiàn)象。

從上面兩組試驗(yàn)的結(jié)果可以分析得出，適合用于鹽藻接種的溫度為40 ℃～45 ℃,瓊脂濃度為0.6%～1.0%。

2.3 培養(yǎng)基鹽度的選擇

鹽藻可在2%～39%鹽度的鹽水中存活，富集β-胡蘿卜素時(shí)鹽度應(yīng)在15%以上。單個(gè)鹽藻細(xì)胞在培養(yǎng)基內(nèi)生長(zhǎng)20 d～30 d才能形成容易觀察的細(xì)胞團(tuán)，該試驗(yàn)的目的是為了找到既能保持鹽藻生長(zhǎng)的鹽度環(huán)境，又不形成結(jié)晶的鹽度。試驗(yàn)選取了五個(gè)培養(yǎng)基的鹽度進(jìn)行試驗(yàn)，分別是4%、6%、8%、10%和12%，結(jié)果見表3。

表3 不同培養(yǎng)基鹽度在30 ℃條件下培養(yǎng)30 d的情況Tab.3 The condition of 30 days in cubation at 30 ℃ with different medium salinity

從表3可見，培養(yǎng)基在30 ℃培養(yǎng)30 d的情況下，鹽度大于10%時(shí)，培養(yǎng)基表面形成鹽結(jié)晶，鹽度低于8%時(shí)不容易形成結(jié)晶。

2.4 接種鹽藻密度的選擇

根據(jù)密度計(jì)算及實(shí)際操作經(jīng)驗(yàn)，選取了1×102個(gè)/L，1×103個(gè)/L，1×104個(gè)/L和1×105個(gè)/L四個(gè)梯度進(jìn)行接種培養(yǎng)試驗(yàn)，結(jié)果見表4。

從表4可見，接種密度在1×102個(gè)/L時(shí)，固體培養(yǎng)基內(nèi)生長(zhǎng)的細(xì)胞團(tuán)較少；接種密度在1×105個(gè)/L時(shí)，細(xì)胞團(tuán)密度大，相互之間有所接觸，挑選單個(gè)細(xì)胞團(tuán)的難度非常大。

表4接種不同密度的鹽藻的培養(yǎng)效果
Tab.4 Culture effect of salina inoculated with different densities

因此，鹽藻在培養(yǎng)基內(nèi)接種的密度不能過低，過低時(shí)可供篩選的細(xì)胞團(tuán)數(shù)量少，容易失去目標(biāo)細(xì)胞；密度濃度過高，細(xì)胞團(tuán)密度大，容易造成相鄰的細(xì)胞團(tuán)之間接觸，失去了篩選的意義，因此，建議的接種密度在1×103個(gè)/L～1×104個(gè)/L為佳。

2.5 新方法培養(yǎng)試驗(yàn)

新方法培養(yǎng)鹽藻的試驗(yàn)是根據(jù)上面試驗(yàn)中得到的接種溫度、瓊脂濃度、培養(yǎng)基鹽度、接種鹽藻密度的結(jié)果或分析，對(duì)其選取端值進(jìn)行具體試驗(yàn)，驗(yàn)證試驗(yàn)效果(見表5)。

表5接種不同密度的鹽藻的培養(yǎng)效果
Tab.5 Experiments on new method of solid culture medium for cultivating dunaliella salina

從表5可見，在所選取的各條件下培養(yǎng)鹽藻，鹽藻細(xì)胞均能形成細(xì)胞團(tuán)(細(xì)節(jié)見圖2、圖3)。接種密度為1×104個(gè)/L時(shí)的細(xì)胞團(tuán)密度明顯高于接種密度為1×103個(gè)/L所形成的細(xì)胞團(tuán)。

3 討論

3.1 目前常用的微藻分離方法在鹽藻分離純化應(yīng)用中的情況

目前，常用的微藻分離方法有稀釋分離法、微吸管分離法、傳統(tǒng)固體培養(yǎng)基分離法，下面將分別討論其在鹽藻方面的應(yīng)用情況。

稀釋分離法，即用滅菌后的培養(yǎng)液把待分離的藻液不斷梯度稀釋，稀釋到每一滴液體中只有一個(gè)微藻細(xì)胞為止。直接將稀釋后的藻液吸取一滴接入預(yù)先準(zhǔn)備好的裝有無菌的培養(yǎng)液中進(jìn)行培養(yǎng)，培養(yǎng)一段時(shí)間后鏡檢，若為單種則分離純化成功，若非單種則需要繼續(xù)純化直到分離出藻液為單種為止[8～9]。該方法操作簡(jiǎn)單，但目的性較差，不一定能分離到所需的單種，需要進(jìn)行大量重復(fù)操作培養(yǎng)，目標(biāo)成功率極低。

微吸管分離法是將玻璃滴管在酒精噴燈上加熱(或玻璃毛細(xì)管在酒精燈上加熱)，用鑷子拉成的極細(xì)的微管。在顯微鏡下把目標(biāo)微藻吸入微吸管，然后接入到預(yù)先準(zhǔn)備好的裝有無菌的培養(yǎng)液中進(jìn)行培養(yǎng)[9]。微吸管分離法是獲得單細(xì)胞藻類最常用并且是成功率最高的方法，也是當(dāng)前鹽藻分離純化中最常用的方法。但微吸管法對(duì)試驗(yàn)儀器和操作人員的要求比較高，且鹽藻細(xì)胞有鞭毛可以游動(dòng)，增加了操作的難度。

傳統(tǒng)固體培養(yǎng)基分離法是在微藻培養(yǎng)基中加入1%～2%的瓊脂進(jìn)行高壓蒸汽滅菌，滅菌后待培養(yǎng)液倒入無菌培養(yǎng)皿中制成固體培養(yǎng)基備用，然后將微藻以劃線、噴霧和涂布的方法接種到培養(yǎng)基表面。該方法是目前淡水藻、海洋微藻和細(xì)菌篩選最常用的方法。但該方法不適合鹽藻的篩選，主要是因?yàn)辂}藻培養(yǎng)液鹽度高，三種方法均是將鹽藻細(xì)胞置于瓊脂培養(yǎng)基表層，這會(huì)導(dǎo)致鹽藻在生長(zhǎng)為細(xì)胞團(tuán)前有鹽析出甚至干掉而導(dǎo)致失敗。

3.2 固體培養(yǎng)基新方法在鹽藻分離純化應(yīng)用中的優(yōu)勢(shì)

固體培養(yǎng)基新方法是在傳統(tǒng)固體培養(yǎng)基方法的基礎(chǔ)上針對(duì)鹽藻設(shè)計(jì)的一種分離純化方法，目前經(jīng)過試驗(yàn)驗(yàn)證其效果非常好。 固體培養(yǎng)基新方法是讓鹽藻在瓊脂內(nèi)部生長(zhǎng)，既可以把鹽藻固定又不影響鹽藻生長(zhǎng)繁殖，非常容易形成單細(xì)胞群落，該方法不僅可用于鹽藻的分離純化，還可用于其他微藻的分離純化使用。

該方法可使單個(gè)的鹽藻細(xì)胞在瓊脂內(nèi)的立體空間中固定，在鹽藻細(xì)胞尚未分裂繁殖時(shí)加以處理或者引導(dǎo)(物理或化學(xué)刺激)，可以使細(xì)胞發(fā)生定向性變異，然后根據(jù)變異的特征從細(xì)胞團(tuán)中選取誘變成功的鹽藻細(xì)胞，進(jìn)而挑選培養(yǎng)。

微藻藻種保存時(shí)需要根據(jù)其繁殖生長(zhǎng)情況定期進(jìn)行更換培養(yǎng)基，硅藻通常在15 d左右更換一次培養(yǎng)基，綠藻通常在25 d左右更換一次培養(yǎng)基，鹽藻根據(jù)培養(yǎng)條件通常在40 d～50 d更換一次培養(yǎng)基。該方法培養(yǎng)微藻因接種密度低，瓊脂保水效果好，即可以延長(zhǎng)保種時(shí)間并且每次接種都能對(duì)微藻進(jìn)行純化。因此，該方法用于微藻藻種的保存,效果非常好。

4 結(jié)論

固體培養(yǎng)基分離純化鹽藻的新方法中，建議接種溫度為40 ℃～45 ℃；瓊脂濃度為0.6%～1.0%；培養(yǎng)基鹽度為6～8%；接種鹽藻細(xì)胞濃度為1×103個(gè)/L～1×104個(gè)/L。該方法操作簡(jiǎn)單，不需要專業(yè)人員操作即可完成，可復(fù)制性強(qiáng)，分離純化效果非常好，特別適合類似于鹽藻等可游動(dòng)的微藻進(jìn)行分離純化。