沙門菌果蠅感染致死模型構(gòu)建及其評價

沙門菌屬(Salmonellaspp)屬腸桿菌科，是一大群寄生于人類和動物腸道內(nèi)、生化反應(yīng)和抗原構(gòu)造相似的革蘭陰性桿菌。沙門菌是一種重要的食源性人獸共患細菌的致病菌，也是研究細菌致病機理的模式菌，是目前國內(nèi)外研究最為廣泛和深入的病原菌之一[1]。

至今，考夫曼-懷特抗原表中沙門菌的血清型可達到2 610種以上。根據(jù)對宿主嗜性的不同，沙門菌可以分為3個群：1) 泛嗜性沙門菌，如鼠傷寒沙門菌和腸炎沙門菌；2) 偏嗜性沙門菌，如豬霍亂沙門菌和都柏林沙門菌，3) 專嗜性沙門菌，如傷寒與甲、乙、丙三型副傷寒沙門菌。根據(jù)對宿主致病能力不同，沙門菌分為無毒型和致病型。盡管沙門菌多種多樣，但許多是對宿主不致病的。致病型沙門菌又分為全身感染型和局部型，全身感染型是指沙門菌能夠擴散至全身，各組織中均有細菌分布；局部感染型是指僅僅在胃腸道感染后，引起胃腸道炎癥[2]。

為了抵抗病原微生物(細菌，病毒，真菌和寄生蟲)不斷威脅，人類和動物這些病原菌感染宿主進化出了強大的免疫防御機制。先天免疫作為第一道防線，破壞入侵的微生物，并引發(fā)有助于阻止病原微生物攻擊的炎癥。獲得性免疫致敏的T細胞和B細胞，產(chǎn)生殺傷細胞和抗體，清除病原微生物及感染細胞[3-4]。

果蠅作為一種模式生物，在胚胎發(fā)育、基因表達調(diào)控、疾病發(fā)病機制以及昆蟲先天免疫等方面的研究發(fā)揮了重要的作用。果蠅的先天免疫系統(tǒng)包括細胞免疫和體液免疫,當其遭受細菌、真菌和病毒等病原體攻擊時，果蠅能通過細胞吞噬、集結(jié)、包囊作用以及產(chǎn)生抗菌肽等方式來清除入侵的微生物[5]。在研究沙門菌致病機理過程中，主要以鼠感染模型和本宿主感染模型為主，以果蠅為感染模型的研究相對較少。為了深入研究沙門菌致病機理，在本研究中利用沙門菌的果蠅感染模型，以不同血清型沙門菌及突變株為研究對象，飼喂和針刺法為沙門菌感染方式，果蠅死亡為觀察結(jié)果，比較沙門菌毒力，發(fā)現(xiàn)不同血清型沙門菌毒力差異，為后續(xù)利用果蠅腸道感染模型研究沙門菌高毒力的功能基因鑒定奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1菌株與果蠅 鼠傷寒沙門菌SL1344，14028S和腸炎沙門菌C50041及其突變株C50041ΔspiC為實驗室保存。CS型果蠅和yw型果蠅，CS型果蠅為野生型黑體紅眼純種果蠅，yw型果蠅則為黃體白眼純種果蠅，由合作者揚州大學(xué)韋有恒教授提供。

1.2 方法

1.2.1果蠅及生長環(huán)境 3 d齡CS果蠅和yw果蠅被使用，并飼養(yǎng)在果蠅管中，其食物配方為：8.5%、2.4%酵母粉、3.0%蔗糖、1.0%瓊脂；培養(yǎng)條件為：溫度為25 ℃，濕度為60%。

1.2.2沙門菌培養(yǎng) 將沙門菌三區(qū)劃線接種于LB固體培養(yǎng)基，培養(yǎng)過夜，取新鮮單菌落接種于100 mL LB 液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)16 h，離心收集細菌，總量約1.0×1011CFU。

1.2.3沙門菌感染果蠅 飼喂法感染果蠅：將沙門菌在5%的蔗糖中配成濃度為OD600為100的懸液，加至濾紙上，將果蠅放在濾紙上培養(yǎng)，每天更換帶有沙門菌的濾紙。針刺法感染果蠅：用細針蘸取OD600為100的沙門菌菌懸液，刺入果蠅背部，然后將果蠅放至正常的果蠅培養(yǎng)基上培養(yǎng)，每隔2 d更換新鮮的含沙門菌培養(yǎng)基。每個感染組有3個生物學(xué)重復(fù)。

1.2.4活果蠅計數(shù) 將感染后的果蠅放于培養(yǎng)箱中，每隔3 h計數(shù)仍然存活的果蠅數(shù)目。根據(jù)存活的比例作存活曲線。

2 結(jié) 果

2.1沙門菌飼喂法腸道感染果蠅的毒力分析 將鼠傷寒沙門菌SL1344，14028S和腸炎沙門菌C50041及其突變株C50041ΔspiC分別單菌落培養(yǎng)50 mL，離心濃縮，用5%蔗糖(含2%亮藍)調(diào)整濃度至OD600=100，每組用0.5 mL濃縮沙門菌感染30只果蠅，間隔3 h計數(shù)活果蠅數(shù)，計算果蠅存活率。圖1 和圖2顯示， 腸炎沙門菌與鼠傷寒沙門菌對果蠅的致死能力有顯著的差別，CS果蠅品系存活率0%，yw果蠅品系存活率低于20%。而鼠傷寒沙門菌飼喂法感染CS果蠅品系和yw果蠅品系存活率高于90%。

2.2沙門菌針刺法非腸道感染果蠅的毒力分析 將鼠傷寒沙門菌SL1344，14028S和腸炎沙門菌C50041及其突變株C50041ΔspiC分別單菌落培養(yǎng)50 mL，離心濃縮至OD600=100，每組用0.5 mL濃縮沙門菌針刺法感染30只果蠅腹部，間隔3 h計數(shù)活果蠅數(shù)，計算果蠅存活率。圖3和圖4顯示，腸炎沙門菌與鼠傷寒沙門菌對果蠅的致死能力有顯著的差別，針刺法感染CS果蠅品系和yw果蠅品系存活率高于80%，針刺法存活率均高于60%。

圖1 CS果蠅飼喂法感染不同沙門菌存活率Fig.1 Survival rate of CS drosophilas by feeding withSalmonellastrains

圖3 CS果蠅針刺法感染不同沙門菌存活率Fig.3 Survival rate of CS drosophilas by acupuncture withSalmonellastrains

圖2 yw果蠅飼喂法感染不同沙門菌存活率Fig.2 Survival rate of yw drosophilas by feeding withSalmonellastrains

圖4 yw果蠅針刺法感染不同沙門菌存活率Fig.4 Survival rate ofywdrosophilas by acupuncture withSalmonellastrains

3 討 論

在病原微生物致病機制研究過程中，有許多感染模型，除本宿主感染模型外，還有模式動物感染模型，如鼠感染模型，斑馬魚感染模型，線蟲感染模型、果蠅感染模型等。

果蠅作為模式動物，有其獨特的優(yōu)勢。果蠅基因組相對簡單，果蠅共有4對染色體，編碼超過14 000個基因，其中3對染色體含有基因組中的大部分基因。研究證明，約75%與人類疾病相關(guān)的基因在果蠅體內(nèi)可以找到同源基因[6]，哺乳動物和果蠅的同源基因在核苷酸水平或蛋白序列上的整體同源性達到 40%，而在保守的功能區(qū)域，同源性可達到80%～90%[7]。另外，果蠅作為模式生物的主要優(yōu)勢之一就是其基因的可操縱性[8-9]。

果蠅已成為研究沙門菌致病機制及宿主對病原菌耐受機制的重要模式生物[10]。Hoffman因在果蠅中發(fā)現(xiàn)了天然免疫系統(tǒng)的Toll受體(類似于哺乳動物的TLR受體)[11]。Brandt等利用果蠅-沙門菌模型，闡明宿主的TNF通路與沙門菌毒力因子PslrP的作用和宿主耐受機制[12]，野生型沙門菌注射至果蠅體內(nèi)，可以導(dǎo)致果蠅死亡，而注射PslrP缺失菌株，僅引起果蠅的慢性感染；同樣注射野生型菌株，也僅引起eiger(TNF同源基因)基因突變果蠅的慢性感染。Lee等利用果蠅-沙門菌模型，發(fā)現(xiàn)PGLYBP2(一種識別細菌表面肽聚糖的識別蛋白)在粘膜防御中保護宿主的作用[13]。Shinzawa利用果蠅遺傳突變，篩選發(fā)現(xiàn)p38在引導(dǎo)果蠅血細胞吞噬沙門菌過程中發(fā)揮重要作用[14]。Jones等在果蠅中發(fā)現(xiàn)毒力因子AvrA通過調(diào)節(jié)JNK通路抑制宿主的免疫反應(yīng)和被感染細胞的凋亡，從而使細菌能夠繁殖[15]。沙門菌是細胞內(nèi)病原菌，可以在宿主細胞內(nèi)增殖。果蠅的S2細胞是來源于果蠅胚胎血祖細胞的細胞系，具有細胞吞噬、產(chǎn)生抗菌肽等能力，被廣泛用于天然免疫的調(diào)節(jié)機制研究。近年來，利用S2細胞研究細胞內(nèi)病原菌如李斯特菌、結(jié)核桿菌等在細胞內(nèi)的增殖機制取得重要進展。果蠅S2細胞也可用于沙門菌在細胞內(nèi)的增殖研究[16]。

沙門菌是研究病原菌致病機制的一種模式病原微生物。沙門菌對不同的宿主的致病能力不同，可能與菌株的宿主嗜性差異有關(guān)。從該研究結(jié)果分析，鼠傷寒沙門菌對果蠅無論是飼喂法還是針刺法感染，致死率都不是很高，顯示其對果蠅的毒力較弱，與其它研究結(jié)果一致[12]。而腸炎沙門菌則不同，飼喂法顯示其毒力很強，而針刺法則顯示其毒力較弱。而在沙門菌鼠感染模型中，這幾種沙門菌均具有很較強的毒力。有趣的是C50041ΔspiC基因缺失株與C50041野生株沙門菌在果蠅感染上模型無明顯差異，而在雞感染模型上則有顯著的差異[17]，而鼠傷寒沙門菌spiC基因后缺失株在鼠感染模型上顯著降低毒力差異[18]，表明spiC對于鼠是重要的毒力因子，而對果蠅則不是重要的毒力因子，提示spiC的功能具有宿主特異性或有特定的互作蛋白。從本研究結(jié)果分析推測，這2種細菌可能對果蠅存在不同的致病機制，腸炎沙門菌果蠅腸道感染的高致病性可能依賴腸道感染，而鼠傷寒沙門菌則不依賴。

在假單胞菌的果蠅感染研究中，發(fā)現(xiàn)了果蠅幾種影響腸道抗感染的免疫新因素，這些基因表達不是來自單一基因，而是多個基因協(xié)同工作的。其中一組基因與分泌抵抗微生物的分子，提高抗病原菌能力有關(guān)。另一組基因與降低活性氧產(chǎn)生，降低免疫反應(yīng)，間接減少炎癥對腸道的傷害有關(guān)。還有些基因有助于加速腸道細胞組織的愈合。而對照組的果蠅則缺乏相關(guān)的基因組，這就意味著，果蠅對病原菌腸道感染的敏感性受到復(fù)雜的調(diào)節(jié)[19]。從鼠傷寒沙門菌和腸道沙門菌果蠅腸道感染存在不同的毒力，鼠傷寒沙門菌果蠅腸道感染耐受，而腸道沙門菌果蠅腸道感染敏感，對沙門菌毒力因子及果蠅腸道感染耐受/敏感的機制需要深入分析。該沙門菌感染果蠅模式能夠為后續(xù)沙門菌腸道感染高致病性的功能基因鑒定及其機制奠定堅實基礎(chǔ)。

利益沖突：無

本文引用格式：耿士忠, 席俊萌, 楊家興, 等. 沙門菌果蠅感染致死模型構(gòu)建及其評價[J]. 中國人獸共患病學(xué)報, 2019,35(4): 311-314. DOI: 10.3969/j.issn.1002-2692.2019.00.028