時(shí)間分辨熒光免疫法檢測(cè)梅毒螺旋體抗體的臨床應(yīng)用研究

賴玉玲 黃麗芳 雷 興

1.廣東省韶關(guān)市第一人民醫(yī)院檢驗(yàn)科，廣東韶關(guān) 512000；2.廣東省韶關(guān)市第一人民醫(yī)院皮膚性病科，廣東韶關(guān) 512000

梅毒（syphilis）是由蒼白密螺旋體（treponema pallidum，TP）引起的細(xì)菌感染性疾病，人類(lèi)是其唯一的傳染源，傳播方式主要是性接觸，血液傳播和垂直傳播[1]。梅毒分期主要有一期，二期，三期和隱性梅毒。根據(jù)臨床發(fā)現(xiàn)，一期和二期梅毒最具傳染性。目前梅毒的診斷主要依靠實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)，尤其是血清學(xué)檢查（主要有非特異性梅毒螺旋體抗體檢測(cè)和特異性梅毒螺旋體抗體檢測(cè)），但目前可用的檢測(cè)手段不能區(qū)分性病梅毒與地方性螺旋體病，容易出現(xiàn)生物學(xué)假陽(yáng)性甚至假陰性的結(jié)果[2-3]。隨著醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)技術(shù)的進(jìn)步，時(shí)間分辨熒光免疫法（TRFIA）逐漸被用于臨床多種疾病的檢測(cè)當(dāng)中，本課題旨在通過(guò)比較時(shí)間分辨熒光免疫法（TRFIA）與梅毒螺旋體顆粒凝集試驗(yàn)（TPPA）、梅毒螺旋體酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（TP-ELISA）在檢測(cè)不同時(shí)期的梅毒的準(zhǔn)確率，探討評(píng)價(jià)時(shí)間分辨熒光免疫法（TRFIA）在梅毒血清學(xué)診斷中的價(jià)值。

1 資料與方法

1.1 一般資料

嚴(yán)格按照梅毒診斷標(biāo)準(zhǔn)篩選，收集2018年1～8月在本醫(yī)院門(mén)診或住院接受治療的100例梅毒干擾患者為研究對(duì)象，男67例，女33例，年齡19～55歲，平均（37.4±9.2）歲，其中一期梅毒19例，均有硬下疳；二期梅毒23例（11例表現(xiàn)為軀干丘疹、掌部銅紅色脫屑性紅斑；5例為外陰、肛周扁平濕疣；7例為脫發(fā)，色素減退斑、礪殼樣痂屑）；三期梅毒10例；隱性梅毒48例。同時(shí)選取100例來(lái)我院體檢的健康人作為健康對(duì)照組，男67例，女33例，年齡19～55歲，平均（35.3±4.1）歲。在征求研究對(duì)象的同意之后，簽署《知情同意書(shū)》，對(duì)其梅毒檢測(cè)情況進(jìn)行回顧性分析。所有人員的平均年齡、病情程度、體質(zhì)、意識(shí)清晰度及醫(yī)生操作技術(shù)水平等方面基線資料，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），具有可比性。

1.2 納入與排除標(biāo)準(zhǔn)[4-5]

納入標(biāo)準(zhǔn)：診斷符合2014年我國(guó)疾病預(yù)防與控制中心《性傳播疾病臨床診療與防治指南》中梅毒的診斷：（1）疑似病例：同時(shí)符合（非梅毒螺旋體血清學(xué)試驗(yàn)陽(yáng)性）和（既往無(wú)梅毒診斷與治療史）項(xiàng)而無(wú)臨床表現(xiàn)者；（2）確診病例：同時(shí)符合疑似病例的要求和兩類(lèi)梅毒血清學(xué)試驗(yàn)均為陽(yáng)性。排除標(biāo)準(zhǔn)：根據(jù)研究?jī)?nèi)容，排除以下三方面的的患者資料：（1）因門(mén)診不能耐受治療副反應(yīng)而住院觀察的首次治療的梅毒患者；（2）入院后未行腰椎穿刺術(shù)無(wú)腦脊液檢查結(jié)果的梅毒住院患者；（3）排除合并因外傷、炎癥、免疫性疾病、HIV感染等引起腦脊液異常的患者以及近3個(gè)月內(nèi)使用糖皮質(zhì)激素或免疫抑制劑者。

1.3 儀器與試劑

時(shí)間分辨熒光免疫法（TRFIA）試劑盒購(gòu)自蘇州新波生物技術(shù)有限公司，應(yīng)用蘇州新波EasyCuta全自動(dòng)時(shí)間分辨熒光分析儀；梅毒螺旋體明膠顆粒凝集試驗(yàn)（TPPA）試劑盒購(gòu)自日本富士瑞必歐株式會(huì)社；梅毒螺旋體酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（TP-ELISA）試劑盒購(gòu)自上?？迫A生物工程股份有限公司，應(yīng)用深圳市匯松發(fā)展有限公司生產(chǎn)的MB-530多功能酶標(biāo)分析儀和PW-960全自動(dòng)酶標(biāo)洗板機(jī)。

1.4 檢測(cè)方法[6-7]

抽取相應(yīng)患者靜脈血4mL，常規(guī)離心分離出血清，分別依據(jù)時(shí)間分辨熒光免疫法（TRFIA）、梅毒螺旋體顆粒凝集試驗(yàn)（TPPA）、梅毒螺旋體酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（TP-ELISA）的試劑盒說(shuō)明書(shū)并嚴(yán)格按照科室SOP文件進(jìn)行操作，具體如下。

表1 三種檢測(cè)方法檢測(cè)結(jié)果比較[n（%）]

1.4.1 時(shí)間分辨熒光免疫法（TRFIA） （1）室溫平衡板條5～10min；（2）微孔板底部加樣本；（3）微孔板底部加生物素標(biāo)記抗原；（4）室溫孵育45min；（5）洗滌；（6）微孔板底部加EU標(biāo)記鏈親和素；（7）室溫孵育 15min；（8）洗滌；（9）加增強(qiáng)液；（10）測(cè)量熒光計(jì)數(shù)值。陽(yáng)性：標(biāo)本S/CO值≥1。陰性：標(biāo)本S/CO值＜1。

1.4.2 梅毒螺旋體顆粒凝集試驗(yàn)（TPPA） （1）室溫平衡試劑盒5～10min；（2）于U型微量反應(yīng)板，每份待測(cè)標(biāo)本標(biāo)記12個(gè)反應(yīng)孔，第1孔加入100μL血清稀釋液，第2～12孔各加入25μL血清稀釋液；（3）取25μL待測(cè)血清加入第1孔中并充分混勻，吸取25μL加入第2孔，如上稀釋，以此類(lèi)推稀釋至第12孔，最后棄去25μL；（4）在第3孔中加入25μL未致敏顆粒溶液，第4～12孔中各加入25μL致敏顆粒溶液；（5）微量振蕩器上混勻30s；（6）加蓋，室溫靜置2h；（7）觀察結(jié)果，統(tǒng)計(jì)陽(yáng)性率和陰性率。陽(yáng)性反應(yīng)：第3孔不出現(xiàn)凝集，第4孔開(kāi)始出現(xiàn)凝集反應(yīng)。陰性反應(yīng)：第3孔、第4～12孔均不出現(xiàn)凝集反應(yīng)。若第3孔出現(xiàn)凝集，實(shí)驗(yàn)無(wú)效，需重新檢測(cè)。

1.4.3 梅毒螺旋體酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（TPELISA） （1）室溫平衡試劑盒 5 ～ 10min；（2）微孔板底部加樣本；（3）37℃避光孵育60mim；（4）洗滌；（5）加酶結(jié)合物，繼續(xù)避光孵育；（6）洗滌；（7）加底物顯色劑，孵育10mim；（8）加終止液，酶標(biāo)儀檢測(cè)；（9）記錄并判定結(jié)果。陽(yáng)性：標(biāo)本OD值大于或等于說(shuō)明書(shū)中已設(shè)定閾值。陰性：標(biāo)本OD值小于說(shuō)明書(shū)中已設(shè)定閾值。

1.5 觀察指標(biāo)

觀察健康對(duì)照組和各周期梅毒患者的TRFIA、TPPA、TP-ELISA的陽(yáng)性百分率，比較梅毒患者的TRFIA、TPPA、TP-ELISA的診斷靈敏度、診斷特異度、陽(yáng)性預(yù)測(cè)值、陰性預(yù)測(cè)值、陽(yáng)性似然比、陰性似然比及經(jīng)濟(jì)費(fèi)用開(kāi)支進(jìn)行評(píng)價(jià)。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

應(yīng)用SPSS19.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計(jì)數(shù)資料以[n（%）]表示，采用χ2檢驗(yàn)：P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 三種檢測(cè)方法檢測(cè)結(jié)果比較

根據(jù)檢測(cè)結(jié)果可知，與健康對(duì)照組相比：TRFIA、TPPA、TP-ELISA三種方法檢測(cè)各周期梅毒患者的陽(yáng)性百分率明顯升高，說(shuō)明三種方法均能較好的識(shí)別梅毒患者血清中相應(yīng)抗體；但與TRFIA相比：TPPA、TP-ELISA法對(duì)一、二、三周期梅毒的陽(yáng)性檢出率有所下降、對(duì)隱性梅毒的陽(yáng)性檢出率顯著下降，可以看出時(shí)間分辨熒光免疫法（TRFIA）的陽(yáng)性檢測(cè)具有更明顯的效果，經(jīng)χ2檢驗(yàn)，TRFIA與TPPA的陽(yáng)性檢出率差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。見(jiàn)表1。

2.2 三種檢測(cè)方法的靈敏度、特異性分析

通過(guò)初步比較后得知，TRFIA法的陽(yáng)性檢測(cè)更具優(yōu)勢(shì)，需進(jìn)一步確認(rèn)其靈敏度和特異性：靈敏度=梅毒患者中陽(yáng)性檢測(cè)數(shù)／梅毒患者總例數(shù)×100%；特異性=健康對(duì)照組中陰性檢測(cè)數(shù)／對(duì)照組總例數(shù)×100%；與TRFIA法比較，TPPA、TP-ELISA法靈敏度下降明顯，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）；特異性差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。見(jiàn)表2。

表2 三種檢測(cè)方法的靈敏度、特異性分析

2.3 三種檢測(cè)方法的陽(yáng)性、陰性預(yù)測(cè)值以及似然比分析

結(jié)合三種檢測(cè)方法的靈敏度和特異性結(jié)果，進(jìn)一步對(duì)其做陰陽(yáng)性預(yù)測(cè)值、似然比的分析：陽(yáng)性預(yù)測(cè)值=陽(yáng)性檢測(cè)結(jié)果中梅毒患者數(shù)／檢測(cè)為陽(yáng)性例數(shù)×100%；陰性預(yù)測(cè)值=陰性檢測(cè)結(jié)果中健康例數(shù)／檢測(cè)為陰性例數(shù)×100%。

陽(yáng)性似然比=靈敏度／（1-特異性）；陰性似然比=（1-靈敏度）／特異性；與TRFIA法比較：TPPA法的陽(yáng)性預(yù)測(cè)值有所增加，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；但陰性預(yù)測(cè)值卻顯著下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），說(shuō)明TPPA法雖有較高陽(yáng)性檢出率，但假陰性較高；與TRFIA法相比：TPELISA法的陽(yáng)性預(yù)測(cè)值有所下降，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。但其陰性預(yù)測(cè)值顯著下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01），提示其假陰性較高，且陽(yáng)性檢出率不如TRFIA法。結(jié)合似然比，與TRFIA法相比：TP-ELISA的陽(yáng)性似然比值顯著下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）；TPPA、TP-ELISA法的陰性似然比雖然與TRFIA差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），但均顯著增加，提示其假陰性較高，即TRFIA的真陽(yáng)性率和真陰性率均更高，診斷效果更好。見(jiàn)表3。

表3 三種檢測(cè)方法的陽(yáng)性、陰性預(yù)測(cè)值分析（%）

2.4 三種檢測(cè)方法的經(jīng)濟(jì)費(fèi)用評(píng)價(jià)

匯總?cè)N檢測(cè)方法假陰性導(dǎo)致復(fù)檢的經(jīng)濟(jì)花費(fèi)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。可知，TRFIA檢測(cè)法由于初檢靈敏度高，假陰性率低，所以復(fù)檢率低，費(fèi)用較少；與TRFIA檢測(cè)法相比，TPPA法復(fù)檢率高，且費(fèi)用較高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）；TP-ELISA法由于單價(jià)較低，雖總體費(fèi)用未超過(guò)TRFIA檢測(cè)法，但因其靈敏度低，導(dǎo)致復(fù)檢率高，需進(jìn)行多次復(fù)檢，給患者徒增負(fù)擔(dān)。見(jiàn)表4。

表4 三種檢測(cè)方法復(fù)檢經(jīng)濟(jì)費(fèi)用評(píng)價(jià)

3 討論

梅毒、麻風(fēng)和結(jié)核在過(guò)去醫(yī)學(xué)并不發(fā)達(dá)的階段被并列稱為世界三大慢性傳染病。其中梅毒因病程長(zhǎng)、傳染期長(zhǎng)、癥狀時(shí)隱時(shí)現(xiàn)、多樣復(fù)雜、有時(shí)臨床表現(xiàn)很不典型，易誤診漏診的特征而導(dǎo)致流行面廣、危害嚴(yán)重[8]。一期梅毒又稱早期梅毒，有感染史，潛伏期一般為2～3周，臨床表現(xiàn)為硬下疳和腹股溝淋巴結(jié)腫大。二期梅毒為有感染史，可有一期梅毒史，病期2年以內(nèi)[9]，臨床表現(xiàn)為皮膚出現(xiàn)梅毒疹，口腔有黏膜斑，全身不適及淺表淋巴結(jié)腫大[10]。三期梅毒又稱晚期梅毒，一般可有一期或二期梅毒史，病期2年以上，臨床表現(xiàn)常見(jiàn)結(jié)節(jié)性皮疹、近關(guān)節(jié)結(jié)節(jié)及皮膚、黏膜、骨骼樹(shù)膠腫等，心臟血管系統(tǒng)受累，以梅毒性腦膜炎、脊髓癆和麻痹性癡呆多見(jiàn)[11]。隱性梅毒有感染史，可有一期、二期或三期梅毒病史，但無(wú)任何梅毒性的臨床癥狀和體征[12]。

目前梅毒的臨床確診，主要依靠實(shí)驗(yàn)室診斷作為依據(jù)，常用的實(shí)驗(yàn)室診斷方法有：病原體檢驗(yàn)（暗視野顯微鏡檢驗(yàn)DFM、梅毒螺旋體制動(dòng)試驗(yàn)TPIT）；血清學(xué)檢測(cè)-非密螺旋體抗原試驗(yàn)（快速血漿/血清反應(yīng)素環(huán)狀卡片試驗(yàn)RPR、甲苯胺紅不加熱血清反應(yīng)素試驗(yàn)TRUST）；血清學(xué)檢測(cè)-密螺旋體抗原試驗(yàn)（梅毒螺旋體熒光抗體吸收試驗(yàn)FTA-ABS、梅毒螺旋體-明膠凝集試驗(yàn)TPPA、梅毒螺旋體-酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)TP-ELISA、梅毒螺旋體-化學(xué)發(fā)光免疫分析CLIA）；基因檢測(cè)（PCR技術(shù)、二聚體蝎型探針定量技術(shù)DSP）[13]。

常用的梅毒螺旋體-明膠凝集試驗(yàn)TPPA、梅毒螺旋體-酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)TP-ELISA法因其特異性低，臨床上經(jīng)常出現(xiàn)假陽(yáng)性或漏檢的現(xiàn)象[14]，因此探索一種新型，快速，受干擾少的檢測(cè)方法十分有必要。時(shí)間分辨熒光免疫法TRFIA是一種非同位素免疫分析技術(shù)，它用鑭系元素標(biāo)記抗原或抗體，根據(jù)鑭系元素螯合物的發(fā)光特點(diǎn)，用時(shí)間分辨技術(shù)測(cè)量熒光，同時(shí)檢測(cè)波長(zhǎng)和時(shí)間兩個(gè)參數(shù)進(jìn)行信號(hào)分辨，可有效地排除非特異熒光的干擾，極大地提高了分析靈敏度，目前已經(jīng)在臨床中廣泛用作多種病毒的實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)手段[15]。

本研究選取符合標(biāo)準(zhǔn)的患者，通過(guò)比較TRFIA、TPPA、TP-ELISA三種方法對(duì)不同時(shí)期的梅毒檢測(cè)的陽(yáng)性率，發(fā)現(xiàn)在無(wú)論是一期、二期、三期梅毒、還是隱性梅毒，TRFIA的陽(yáng)性檢測(cè)率均為最高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。進(jìn)一步分析其靈敏度、特異性、陽(yáng)性和陰性預(yù)測(cè)值、陽(yáng)性和陰性似然比，發(fā)現(xiàn)TRFIA的靈敏度最強(qiáng)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01），特異性雖無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，但結(jié)合似然比，當(dāng)陽(yáng)性似然比＞10或陰性似然比＜0.1時(shí)，診斷或排除某種疾病的可能性將顯著增加，由此可知，TRFIA法的臨床應(yīng)用價(jià)值最高。

此外，通過(guò)對(duì)三種檢測(cè)方法的經(jīng)濟(jì)評(píng)價(jià)，發(fā)現(xiàn)TRFIA法的復(fù)測(cè)率最低，相應(yīng)花費(fèi)較低，TPPA和TP-ELISA由于假陰性率高導(dǎo)致復(fù)檢次數(shù)增加，給患者帶來(lái)經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)的同時(shí)，也對(duì)疾病的及時(shí)確診和治療造成了延誤。

綜上，可以判定時(shí)間分辨熒光免疫法TRFIA用于梅毒的實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)，具有靈敏度強(qiáng)，抗干擾度高的優(yōu)勢(shì)，在很大程度上能夠降低假陽(yáng)性和漏檢的事件發(fā)生。