白藜蘆醇對(duì)產(chǎn)蛋后期蛋雞肝臟抗氧化酶活性和mRNA表達(dá)的影響

■李生杰 趙國(guó)先 劉彥慈 馬可為 郝艷霜 劉觀(guān)忠 馮志華*

（1.河北農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院，河北保定071000；2.河北保定職業(yè)技術(shù)學(xué)院，河北保定071000）

白藜蘆醇（Resveratrol，Res），一種稱(chēng)為反式3,5- 4，三羥基雙苯乙烯的化學(xué)物質(zhì)，當(dāng)植物受到某些細(xì)菌的感染或者是處于惡化的環(huán)境中時(shí)，能夠產(chǎn)生這種天然多酚類(lèi)的物質(zhì)，為一種抗毒素，具有保健和多種重要的生物學(xué)功能。天然存在于多種植物或水果，如葡萄、松樹(shù)、花生和決明子。Res具有抗氧化、防腐、抗腫瘤的作用[1]，另外還能治療炎癥、心臟病，能發(fā)揮一定作用，并且還能調(diào)節(jié)脂代謝紊亂，使其恢復(fù)正常平衡狀態(tài)[2]。近年來(lái)，食品添加劑、保健品、化妝品、醫(yī)藥等行業(yè)研究生物活性物質(zhì)對(duì)身體健康有益的生物藥理作用，使一些生物活性物質(zhì)得到廣泛使用。在畜禽養(yǎng)殖中，有研究表明，雞肉和豬肉的品質(zhì)以及肉雞的免疫功能都會(huì)因?yàn)橛袡C(jī)物的添加而提高，但是在蛋雞方面的研究未見(jiàn)報(bào)道。本試驗(yàn)旨在研究日糧中添加不同量的Res 對(duì)產(chǎn)蛋后期蛋雞抗氧化能力和相關(guān)基因表達(dá)有何影響，并初步探究其分子機(jī)理，為綠色飼料添加劑的研發(fā)提供理論依據(jù)，促進(jìn)蛋雞產(chǎn)業(yè)健康可持續(xù)發(fā)展。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

Res（純度≥50%，上海諾特生物科技公司提供）。

1.2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)與試驗(yàn)日糧

試驗(yàn)采用單因子完全隨機(jī)區(qū)組設(shè)計(jì)，挑選360只60 周齡健康無(wú)病且體重和產(chǎn)蛋率相近的京粉1 號(hào)蛋雞，隨機(jī)分成5 組，每組6 個(gè)重復(fù)，每個(gè)重復(fù)有12 只雞。對(duì)照組飼喂基礎(chǔ)日糧（基礎(chǔ)日糧組成和營(yíng)養(yǎng)水平見(jiàn)表1）。試驗(yàn)組在基礎(chǔ)日糧上分別添加0.05%、0.10%、0.20%、0.40%量的Res?；A(chǔ)飼糧在參照NRC（1994）和中華人民共和國(guó)農(nóng)業(yè)行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)NY/T33—2004 的基礎(chǔ)上，結(jié)合京粉1 號(hào)蛋雞飼養(yǎng)管理手冊(cè)配制。預(yù)試期1周，試驗(yàn)期為8周。

表1 基礎(chǔ)飼糧組成及營(yíng)養(yǎng)水平（風(fēng)干基礎(chǔ)）

1.3 飼養(yǎng)管理

半開(kāi)式3層實(shí)心籠，上、中、下三排梯籠架平均分布。利用天然和人工兩種補(bǔ)光方式，保持其強(qiáng)度為14 LX 且每天要有16 h 光照。自由采食，喂干粉，于每天上午8：30 和下午14：00 各喂1 次，采用乳頭式飲水。安排專(zhuān)人負(fù)責(zé)防疫程序，每天撿蛋一次，每周進(jìn)行一次雞糞清理。每天注意察看雞的精神狀態(tài)，及時(shí)清除死雞并記錄數(shù)量。

1.4 樣品采集

在試驗(yàn)結(jié)束時(shí)最后1 d時(shí)，每個(gè)重復(fù)選2只蛋雞，每組共選12只，總共60只。首先對(duì)其禁食供水，12 h之后于頸靜脈進(jìn)行采血，將所采血液靜置至有部分血清析出之后，再將其在3 500 r/min條件下離心10 min，最后收集血清分裝保存于-20 ℃，待測(cè)血清抗氧化指標(biāo)。將所選雞只屠宰，在頸靜脈進(jìn)行放血，去毛之后在右側(cè)肝臟和胸肌同一部位取樣，并用生理鹽水沖洗樣品表面血漬，之后用5 ml離心管盛放且立即放入液氮中進(jìn)行冷凍一段時(shí)間，最后放置于-20 ℃保存留用，用以測(cè)定抗氧化酶酶活活性；另外在左側(cè)肝葉中部位置切取兩塊筋膜較少的組織，分裝于兩個(gè)1.5 ml無(wú)RNA 酶的EP 管中，迅速投入液氮（開(kāi)膛后2 min內(nèi)），然后放置于-80 ℃冰箱中保存，分子樣品在1 個(gè)月內(nèi)檢測(cè)。

1.5 抗氧化指標(biāo)的測(cè)定

1.5.1 肝臟抗氧化酶活性的測(cè)定

試劑的配制和試驗(yàn)操作均按說(shuō)明書(shū)進(jìn)行，測(cè)定的指標(biāo)包括總超氧化物歧化酶(T-SOD)活性、丙二醛(MDA)含量、總抗氧化能力(T-AOC)、谷胱甘肽過(guò)氧化物酶(GSH-Px)活性均用試劑盒(南京建成生物工程研究所)測(cè)定。

1.5.2 肝臟中抗氧化酶mRNA相對(duì)表達(dá)量的測(cè)定

1.5.2.1 總RNA提取

從肝臟中提取總RNA，并使用電泳檢測(cè)RNA的完整性。電泳檢測(cè)-RNA 電泳結(jié)果(1.5%瓊脂糖，1×TAE 電泳緩沖液，紫外透射光下察看并拍照)(見(jiàn)圖1)。

1.5.2.2 反轉(zhuǎn)錄

實(shí)驗(yàn)試劑為第一鏈cDNA 合成試劑盒（AMV First Strand cDNA Synthesis Kit）(SK2445)，cDNA 第一鏈合成依照說(shuō)明書(shū)操作。將上述模板cDNA 分裝到若干小管中-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.5.2.3 肝臟PGC-1α、Nrf2、Mn-SOD 和Cu/Zn-SOD基因的引物設(shè)計(jì)與合成

PGC-1α、Nrf2、Mn-SOD 和Cu/Zn-SOD 基因的引物設(shè)計(jì)見(jiàn)表2，上海生物工程技術(shù)公司提供合成的引物。

圖1 蛋雞肝臟總RNA 凝膠電泳圖

1.5.2.4 實(shí)時(shí)熒光定量PCR（qRT-PCR）檢測(cè)

試驗(yàn)樣本：該cDNA 樣本在機(jī)器上被稀釋為模板的8倍。

實(shí)時(shí)定量PCR 試劑：ABI SybrGreen PCR Master Mix（2X）。

定 量PCR 儀：LightCycler480 Software Setup(Roche 羅氏)。

PCR反應(yīng)步驟：

①配制反應(yīng)混合液10 μl SybrGreen qPCR Master Mix（2X），1 μl引物F(10 μM)，1 μl引物R(10 μM)，6 μl dd H2O，2 μl Template (cDNA)。

②PCR 循環(huán)條件：95 ℃3 min，95 ℃15 s，60 ℃40 s，進(jìn)行40個(gè)循環(huán)。

1.6 數(shù)據(jù)處理與統(tǒng)計(jì)分析

以重復(fù)為單位，使用SAS 8.0 軟件進(jìn)行試驗(yàn)數(shù)據(jù)的分析，使用One-way ANOVA進(jìn)行方差分析，并進(jìn)行一次線(xiàn)性回歸分析。鄧肯法用于顯著性差異的多重比較。結(jié)果以“X±標(biāo)準(zhǔn)差SD”表示。

表2 目的基因及內(nèi)參Real-time PCR 引物序列

2 結(jié)果與分析

2.1 對(duì)肝臟抗氧化酶活性的影響

日糧中添加Res 對(duì)蛋雞肝臟抗氧化指標(biāo)的影響見(jiàn)表3。由表3 可見(jiàn)，蛋雞日糧中添加不同水平的白藜蘆醇對(duì)其肝臟中MDA 活性均無(wú)顯著影響（P＞0.05）。隨著Res 添加水平的提高，蛋雞肝臟T-AOC、T-SOD 和GSH-Px 的活性顯著增加（P＜0.01），且與Res添加量之間呈線(xiàn)性相關(guān)（P＜0.01）。

表3 Res對(duì)蛋雞肝臟抗氧化指標(biāo)的影響

2.2 對(duì)肝臟中抗氧化酶mRNA相對(duì)表達(dá)量的影響

日糧中添加Res 對(duì)蛋雞肝臟PGC-1α、Nrf2、Mn-SOD和Cu/Zn-SOD mRNA 表達(dá)的影響見(jiàn)表4。由表4可見(jiàn)，日糧中添加不同水平的白藜蘆醇對(duì)蛋雞肝臟中PGC-1α和Nrf2 mRNA 的表達(dá)量均無(wú)顯著影響（P＞0.05）。隨著Res添加水平的升高，蛋雞肝臟Mn-SOD和Cu/Zn-SOD的mRNA表達(dá)量均呈顯著線(xiàn)性增加（P＜0.01），0.20%組、0.40%組Mn-SOD 的mRNA 表達(dá)量較對(duì)照組極顯著提高（P＜0.01），但兩組間無(wú)顯著性差異（P＞0.05）。0.10%、0.20%組和0.40%組Cu/Zn-SOD 的mRNA 表達(dá)量對(duì)照組極顯著提高（P＜0.01），三組間無(wú)顯著性差異（P＞0.05）。

表4 Res對(duì)蛋雞肝臟PGC-1α、Nrf2、Mn-SOD和Cu/Zn-SOD mRNA表達(dá)的影響

3 討論

3.1 Res對(duì)產(chǎn)蛋后期蛋雞肝臟抗氧化指標(biāo)的影響

現(xiàn)代規(guī)?；⒓s化生產(chǎn)條件下，產(chǎn)蛋雞易受到生產(chǎn)過(guò)程中的免疫接種、飼養(yǎng)密度、熱或冷應(yīng)激、圈舍氨氣及驚嚇等因素的影響，導(dǎo)致蛋雞機(jī)體的氧化還原平衡狀態(tài)受到破壞而發(fā)生氧化應(yīng)激反應(yīng)造成抵抗力下降，生產(chǎn)性能降低，影響生產(chǎn)效益。隨著產(chǎn)蛋雞進(jìn)入產(chǎn)蛋后期，其身體機(jī)能各項(xiàng)指標(biāo)都有所下降，如果雞只飼養(yǎng)密度過(guò)高以及長(zhǎng)期排卵，這時(shí)候容易引起氧化應(yīng)激反應(yīng)。隨著雞的日齡增加，其體內(nèi)的一些抗氧化酶活性下降，導(dǎo)致其氧化/抗氧化平衡系統(tǒng)發(fā)生紊亂，機(jī)體不能及時(shí)清除掉自由基，導(dǎo)致自由基的數(shù)量有所增加，代謝紊亂、組織器官功能下降、細(xì)胞功能的退化均和自由基的數(shù)量增多有關(guān)，影響蛋雞健康和產(chǎn)蛋性能。

總抗氧化能力（T-AOC）、谷胱甘肽過(guò)氧化物酶（GSH-Px）、總超氧化物歧化酶（T-SOD）和丙二醛（MDA）可以反映機(jī)體的抗氧化能力。抗氧化功能綜合評(píng)價(jià)指標(biāo)使用總抗氧化能力（T-AOC），機(jī)體自由基代謝的情況以及受到環(huán)境刺激時(shí)其代償能力情況都可用總抗氧化能力大小來(lái)反映。GSH-Px在還原型谷胱甘肽(GSH)轉(zhuǎn)變?yōu)檠趸偷墓入赘孰?GSSG)方面發(fā)揮重要作用，機(jī)體中的過(guò)氧化氫及脂質(zhì)過(guò)氧化物也可被其清除掉，達(dá)到保護(hù)機(jī)體的目的。超氧化物歧化酶具有非常重要的作用，可以防止發(fā)生一些生理病變，使機(jī)體內(nèi)的氧自由基保持在一定的數(shù)量，能夠清除體內(nèi)的超氧陰離子，并且可以和超氧陰離子自由基發(fā)生歧化反應(yīng)，生成過(guò)氧化氫，被認(rèn)為是抗氧化系統(tǒng)的第一道防線(xiàn)。例如，當(dāng)身體處于病理或者衰老狀態(tài)時(shí)，由于SOD 的突然降低而引起的自由基急劇增加。脂質(zhì)過(guò)氧化物的含量水平可以由MDA含量的大小來(lái)間接反反映，因?yàn)槭侵|(zhì)過(guò)氧化物所氧化形成的最終產(chǎn)物，說(shuō)明活性氧（ROS）自由基攻擊對(duì)機(jī)體脂質(zhì)有損傷作用。本試驗(yàn)結(jié)果顯示，肝臟中T-AOC、T-SOD 和GSH-Px的活性亦隨著白藜蘆醇水平的升高而顯著增加。提示白藜蘆醇增強(qiáng)機(jī)體抗氧化功能的機(jī)理是提高體內(nèi)抗氧化酶的活性，抑制脂質(zhì)過(guò)氧化反應(yīng)。與本結(jié)果類(lèi)似，周玲芝[3]報(bào)道，急性酒精肝損傷小鼠血清與肝組織SOD、GSH-Px活力會(huì)因白蘆藜醇添加而升高，血清與肝組織MDA含量會(huì)隨著白蘆藜醇的添加而下降。張彩云等[4]報(bào)道，0.10%白藜蘆醇可顯著提高血清T-AOC 水平，顯著降低血清MDA 水平，0.20%白藜蘆醇能顯著提高T-SOD活性及其在肉雞肝臟T-AOC水平，顯著降低肝組織MDA含量；Sridhar等[5]研究報(bào)道，在肉仔雞日糧中添加白藜蘆醇可以提高其抗氧化水平，并有效抵御AFB1-誘導(dǎo)的毒性反應(yīng)。竇健霖等[6]報(bào)道白藜蘆醇可增加血清抗氧化酶GSH-PX、GST、CAT、T-SOD、GSH 活性，降低MDA 含量，這一作用呈一定的量效關(guān)系。另有研究表明，白藜蘆醇可使鵪鶉血清中MDA含量呈線(xiàn)性下降；肝臟中SOD[7]、CAT和、GSH-Px 活性以及Nrf2 的表達(dá)成線(xiàn)性增加[8]。Baxter[9]發(fā)現(xiàn)，白藜蘆醇阻止自由基或脂質(zhì)（peroxidation)氧化的生物學(xué)效率是95%，而傳統(tǒng)的抗氧化劑如VE和VC分別是65%和37%。Zhu 等[10]報(bào)道，在大鼠日糧中添加白藜蘆醇可以降低血清MDA 濃度，同時(shí)增加肝組織的谷胱甘肽含量和GPx 活性以及血清SOD 水平。Zhang 等[11]報(bào)道，育肥豬日糧中添加白藜蘆醇可以提高肌肉中T-AOC、GPx 活性和GPx mRNA 水平，提示其抗氧化能力的增強(qiáng)。

3.2 Res對(duì)產(chǎn)蛋雞肝臟Nrf2、PGC-1α、Mn-SOD和Cu/Zn-SOD mRNA水平的影響

調(diào)控抗氧化酶基因表達(dá)的主要核轉(zhuǎn)錄因子為Nrf2（Nuclear factor erythroid 2-related factor 2），被激活進(jìn)入細(xì)胞核與抗氧化酶作用元件結(jié)合后調(diào)控抗氧化酶的基因表達(dá)。PGC-1α 作為一種具有多重功能的輔因子，除了在能量代謝中具有重要作用外[12]，還可通過(guò)GSH-Px 和SOD 等抗氧化酶有效調(diào)控活性氧代謝[13]。Wu 等[14]報(bào)道，PGC-1α可通過(guò)刺激核呼吸因子Nrf2 轉(zhuǎn)錄調(diào)控與ARE調(diào)節(jié)有關(guān)的抗氧化酶的基因表達(dá)[15]來(lái)誘導(dǎo)SOD 和GSH-Px 等酶的產(chǎn)生[16]。在當(dāng)前研究中，白藜蘆醇對(duì)蛋雞肝臟中PGC-1α和Nrf2 mRNA 的表達(dá)量均無(wú)顯著影響（P＞0.05），但有升高的趨勢(shì)，這說(shuō)明白藜蘆醇可能在一定程度上激活PGC-1α-Nrf2-ARE-抗氧化酶反應(yīng)通路增加相關(guān)抗氧化酶的mRNA表達(dá)。

SOD是一種金屬酶，其所包含的蛋白質(zhì)部分和結(jié)合到蛋白活性部位的金屬離子都能夠影響它的酶活性和理化性質(zhì)。按其所含金屬輔基的不同，將其劃分為Fe-SOD、Mn-SOD、Cu/ZnSOD、Ni-SOD、Mn/FeSOD和Fe/ZnSOD 六種不同的酶，目前研究較多的兩種酶為Cu/ZnSOD 和Mn-SOD。原核生物和真核生物甲殼動(dòng)物的線(xiàn)粒體中含有大量的錳超氧化物歧化酶，細(xì)胞質(zhì)中也含有少量的這種酶；Cu/ZnSOD 廣泛存在于細(xì)胞中，其含量占到總SOD 的90%，其作用是維持氧自由基的平衡、清除轉(zhuǎn)移超氧陰離子自由基、集體防御氧化損傷，是一種重要的金屬酶。在本研究中，日糧中添加適宜水平的白藜蘆醇可使蛋雞肝臟Mn-SOD和Cu/Zn-SOD的mRNA表達(dá)量顯著增加，與本試驗(yàn)肝臟和血清中T-SOD 和GSH-Px 等抗氧化酶的活性增加的結(jié)果是一致的。抗氧化酶基因表達(dá)量的增加可以促進(jìn)酶活的提高，因此，白藜蘆醇可能以增加Mn-SOD 和Cu/Zn-SOD 表達(dá)的方式發(fā)揮其抗氧化作用，其詳細(xì)機(jī)制還需進(jìn)一步深入研究。

4 結(jié)論

本試驗(yàn)的研究結(jié)果顯示，飼糧中添加適量白藜蘆醇可以增強(qiáng)蛋雞血清中谷胱甘肽過(guò)氧化物酶和總超氧化物歧化酶的活性，使血清丙二醛含量下降；隨著白藜蘆醇水平的升高，肝臟中谷胱甘肽過(guò)氧化物酶、總超氧化物歧化酶的活性和總抗氧化能力會(huì)相應(yīng)增強(qiáng)，肝臟中的Mn-SOD和Cu/Zn-SOD酶的mRNA表達(dá)量也會(huì)上升。由此可見(jiàn)，白藜蘆醇可能是通過(guò)調(diào)節(jié)抗氧化酶基因的表達(dá)和活性變化發(fā)揮抗氧化作用，但其具體作用機(jī)理仍需要進(jìn)一步研究。