沙利度胺對(duì)宮頸癌裸鼠移植瘤的放療增敏作用及其機(jī)制研究

楊麗萍 侯俊德 劉凌凌 馬建彩 王玉紅 孟慧芳

宮頸癌是嚴(yán)重危害婦女健康和生命的最常見惡性腫瘤之一[1]，其發(fā)病率及病死率在我國(guó)呈上升趨勢(shì)，且日趨年輕化[2]。目前放療是宮頸癌的重要輔助治療手段，然而，腫瘤細(xì)胞本身對(duì)放療的敏感性較差，如何提高實(shí)體瘤的放療敏感性一直是放療生物學(xué)的重要課題。因此，尋找一種放療增敏劑是當(dāng)前研究的熱點(diǎn)。有研究證實(shí)沙利度胺可增強(qiáng)食管癌、結(jié)腸癌細(xì)胞的放療敏感性[3-4]，但沙利度胺與宮頸癌放療敏感性關(guān)系的研究較少見。本研究通過(guò)建立人宮頸癌裸鼠移植瘤模型，觀察沙利度胺對(duì)宮頸癌的放療增敏作用，并探討其可能的作用機(jī)制。

1 材料和方法

1.1 細(xì)胞來(lái)源和實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 人宮頸癌細(xì)胞株Hela親本細(xì)胞株來(lái)源于中國(guó)科學(xué)院上海細(xì)胞庫(kù)，由河北醫(yī)科大學(xué)細(xì)胞實(shí)驗(yàn)中心提供。在含10%FBS的DMEM培養(yǎng)基中貼壁生長(zhǎng)，置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每3～4d傳代一次。5周齡雄性BALB/c裸鼠20只，體重20～23g，購(gòu)于河北醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心，并在該校實(shí)驗(yàn)室SPF級(jí)別動(dòng)物房普通飼料喂養(yǎng)，自由飲水。

1.2 主要試劑及設(shè)備儀器 沙利度胺（批號(hào)：20030302，規(guī)格：25mg/片）購(gòu)自江蘇常州制藥廠，小鼠抗人血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）單克隆抗體（批號(hào)：1467P306）和即用型細(xì)胞免疫組化（SABC法）試劑盒（批號(hào)：SA1022）購(gòu)自北京中山生物技術(shù)工程公司，電子數(shù)顯卡尺購(gòu)自成都成量工具有限公司（精確度0.01mm），電子天平（FA2004型）購(gòu)自美國(guó)Chem Focus公司。

1.3 模型建立與實(shí)驗(yàn)分組 收集處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的Hela細(xì)胞，稀釋至1×107/ml；無(wú)菌條件下將0.2ml Hela細(xì)胞懸濁液接種于所有BALB/c裸鼠。1周后測(cè)得所有裸鼠均已成瘤，且移植瘤的直徑達(dá)到8mm。采用隨機(jī)數(shù)字表法將20只小鼠分為對(duì)照組、沙利度胺組、單純放療組（20Gy組）和沙利度胺聯(lián)合放療組（沙利度胺+20Gy組）4組，每組5只。對(duì)照組：腹腔注射0.2ml 0.5%羧甲基纖維鈉，1次/d，連續(xù)14d；沙利度胺組：沙利度胺用0.9%氯化鈉注射液配成25mg/ml，腹腔注射0.2ml沙利度胺溶液，1次/d，連續(xù)14d；20Gy組：照射時(shí)小鼠處于麻醉狀態(tài)（用5%水合氯醛，按0.005ml/g腹腔注射，麻醉成功后，將其捆綁固定），用6MVX線照射，按常規(guī)放療，2Gy/d，5次/周，共10次；照射部位為裸鼠腋部移植瘤瘤體，其余部位用鉛屏蔽處理；沙利度胺+20Gy組：腹腔注射0.2ml沙利度胺溶液，1次/d，連續(xù)14d；放療措施同20Gy組。

1.4 腫瘤體積和抑瘤率測(cè)定 治療第1天開始用電子數(shù)顯卡尺測(cè)量腫瘤的最長(zhǎng)徑（L）和最短徑（W），每2d測(cè)量 1 次，并計(jì)算移植瘤體積（V），V=L×W2×π/6，其中系數(shù)π/6≈0.52。治療后第14天頸椎脫臼處死動(dòng)物，剝瘤稱重（g），計(jì)算抑瘤率，抑瘤率=（對(duì)照組平均瘤重－給藥組平均瘤重）/對(duì)照組平均瘤重×100%。取出皮下移植瘤，用10%甲醛固定后，制成石蠟切片備用。

1.5 移植瘤組織中VEGF的免疫組化檢測(cè) 移植瘤標(biāo)本經(jīng)固定、包埋、切片后，按免疫組化SABC法進(jìn)行染色，檢測(cè)移植瘤組織中VEGF的表達(dá)。操作步驟嚴(yán)格按試劑說(shuō)明書，PBS代替一抗作陰性對(duì)照。結(jié)果判斷標(biāo)準(zhǔn)：VEGF以胞膜或胞質(zhì)出現(xiàn)棕黃色均勻顆粒的為陽(yáng)性細(xì)胞。在400倍光鏡下隨機(jī)選取 10個(gè)視野，分別計(jì)數(shù)每個(gè)視野內(nèi)的陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)，計(jì)算陽(yáng)性細(xì)胞的百分比：＜10%為陰性（-），10%～33%為弱陽(yáng)性（+），34%～66%為陽(yáng)性（++）；＞66%為強(qiáng)陽(yáng)性（+++）。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS 19.0統(tǒng)計(jì)軟件。計(jì)量資料以表示，多組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 4組裸鼠腫瘤體積比較 如圖1所示，以觀察時(shí)間作為橫軸、移植瘤體積作為縱軸，繪制移植瘤生長(zhǎng)曲線。治療前各組宮頸癌Hela腫瘤體積比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。治療后14d對(duì)照組、沙利度胺組、20Gy組和沙利度胺+20Gy組腫瘤體積分別為（0.85±0.14）、（0.71±0.12）、（0.66±0.10）和（0.51±0.09）cm3。與對(duì)照組比較，沙利度胺組、20Gy組和沙利度胺+20Gy組腫瘤體積均明顯減小，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.05）；與沙利度胺組和20Gy組比較，沙利度胺+20Gy組腫瘤體積均明顯減小，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.05）。

圖1 4組移植瘤生長(zhǎng)曲線比較

2.2 各組裸鼠瘤重和抑瘤率比較 治療后14d，與對(duì)照組比較，沙利度胺組、20Gy組和沙利度胺+20Gy組瘤重均明顯降低，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.05）；與沙利度胺組和20Gy組比較，沙利度胺+20Gy組瘤重均明顯降低，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.05）。與對(duì)照組比較，沙利度胺組、20Gy組和沙利度胺+20Gy組抑瘤率均明顯升高，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.05）；與沙利度胺組和20Gy組比較，沙利度胺+20Gy組抑瘤率均明顯升高，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.05），見表2。

2.3 各組裸鼠移植瘤組織中VEGF的表達(dá)情況比較對(duì)照組、沙利度胺組、20Gy組和沙利度胺+20Gy組裸鼠移植瘤組織中VEGF表達(dá)分別呈強(qiáng)陽(yáng)性、陽(yáng)性、陽(yáng)性和弱陽(yáng)性，后3組與對(duì)照組相比VEGF表達(dá)均下降，其中沙利度胺+20Gy組下降最明顯，見圖2。

表2 治療后14d各組裸鼠瘤重和抑瘤率比較

圖2 各組裸鼠移植瘤組織中VEGF的表達(dá)情況比較（a：對(duì)照組；b：沙利度胺組；c：20Gy組；d：沙利度胺+20Gy組；SABC法，×400）

3 討論

放療是多數(shù)實(shí)體瘤的主要治療手段，如何提高實(shí)體瘤的放療敏感性一直是放療生物學(xué)的重要課題。近年來(lái)興起的分子靶向治療不僅具有獨(dú)特的抗腫瘤作用，而且與傳統(tǒng)的放化療具有明顯的協(xié)同作用[5-6]。沙利度胺曾因嚴(yán)重的致畸作用而被禁用，但對(duì)其研究并未停止。近年研究發(fā)現(xiàn)，沙利度胺具有抗腫瘤作用，并可通過(guò)直接抑制VEGF表達(dá)，調(diào)節(jié)細(xì)胞遷移和黏附，抑制血管形成[7]。VEGF是最重要的促血管生成因子之一，其與腫瘤的發(fā)展及放療敏感性密切相關(guān)[8-9]。有研究表明VEGF在宮頸癌組織中高表達(dá)，且與腫瘤分期、轉(zhuǎn)移、預(yù)后有關(guān)[10]。國(guó)內(nèi)外已有報(bào)道沙利度胺用于多種實(shí)體瘤的治療[11-14]。但沙利度胺與放療結(jié)合治療宮頸癌的研究較少報(bào)道。本研究通過(guò)建立人宮頸癌裸鼠移植瘤模型，觀察沙利度胺對(duì)宮頸癌的放療增敏作用，希望將抗血管生成藥物與放療結(jié)合起來(lái)治療宮頸癌以期獲得更好的療效。本研究顯示，沙利度胺組、20Gy組和沙利度胺+20Gy組腫瘤體積和瘤重均低于對(duì)照組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；且與沙利度胺組、20Gy組相比，沙利度胺+20Gy組均明顯降低，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。此結(jié)果表明沙利度胺與放療都能抑制移植瘤生長(zhǎng)，且沙利度胺夠增強(qiáng)裸鼠移植瘤細(xì)胞對(duì)放療的敏感性。免疫組化結(jié)果提示沙利度胺組、20Gy組VEGF表達(dá)呈陽(yáng)性，而沙利度胺+20Gy組VEGF表達(dá)呈弱陽(yáng)性，均低于對(duì)照組的強(qiáng)陽(yáng)性。提示沙利度胺放療增敏作用可能與抑制VEGF的表達(dá)有關(guān)，并通過(guò)抑制VEGF的表達(dá)來(lái)增強(qiáng)其放療作用。

本研究證實(shí)了沙利度胺聯(lián)合放療能夠顯著提高Hela宮頸癌小鼠移植瘤的放療敏感性，其機(jī)制可能與降低腫瘤組織中VEGF的表達(dá)有關(guān)，為沙利度胺成為新型放療增敏藥及臨床治療宮頸癌提供了理論依據(jù)。