化學(xué)發(fā)光法檢測肺炎衣原體抗體的性能評估

周 湧，李慧敏，李夏萌

(東莞市第五人民醫(yī)院檢驗(yàn)科，廣東東莞 454002)

肺炎衣原體(CP)是社區(qū)獲得性肺炎(CAP)中非常重要的非典型病原體之一[1]。研究表明,CP可能誘發(fā)CAP患者的慢性咳嗽(CC)。CC是復(fù)發(fā)性和難治性呼吸系統(tǒng)疾病之一，導(dǎo)致CAP的延遲治愈。雖然，CAP通常不會產(chǎn)生嚴(yán)重的臨床結(jié)局，但是如果遷延不愈也可以引起多種器官的并發(fā)癥，影響患者的生理和心理健康[2]。另外，CAP通常也合并有其他的細(xì)菌感染[3]。因此，發(fā)明快速而準(zhǔn)確的實(shí)驗(yàn)室檢測方法對于CP感染的早期診斷和早期治療非常關(guān)鍵。目前，對于CP的實(shí)驗(yàn)室檢測方法包括病原體分離培養(yǎng)法、直接檢測法、熒光定量核酸擴(kuò)增法(FQ-PCR)以及血清檢測法。血清檢測法又包括化學(xué)發(fā)光法(CLIA)、酶聯(lián)免疫吸附測定(ELISA)以及間接免疫熒光(IIF)等。ELISA實(shí)驗(yàn)步驟多，干擾環(huán)節(jié)多；IIF只能檢測IgM，而目前對于CLIA在CP抗體檢測中的作用卻缺乏研究。本研究擬探討化學(xué)發(fā)光法(CLIA)檢測肺炎衣原體IgG和IgM抗體的性能，并且與ELISA和IIF相比較，以期為臨床上采用這種方法早期診斷CP造成的CAP提供一定的理論依據(jù)。

1 資料與方法

1.1一般資料 選擇2015年1月至2017年12月在本院呼吸內(nèi)科接受治療的200例CP患者作為觀察組，男115例，女85例，年齡4～80歲，平均(31.2±4.5)歲。納入標(biāo)準(zhǔn)：(1)成人CAP感染符合中華醫(yī)學(xué)會呼吸病學(xué)分會制定的《中國成人社區(qū)獲得性肺炎診斷和治療指南(2016年版)》的相關(guān)診斷標(biāo)準(zhǔn)[4]。(2)兒童CAP感染符合中華醫(yī)學(xué)會兒科學(xué)分會呼吸學(xué)組制定的《兒童社區(qū)獲得性肺炎管理指南(2013修訂)》中的相關(guān)診斷標(biāo)準(zhǔn)[5]；(3)臨床上出現(xiàn)不同程度的發(fā)熱、咳嗽、咳痰癥狀，可伴有呼吸困難、惡性嘔吐等癥狀。(4)結(jié)合患者的血常規(guī)、肺部X線片、痰培養(yǎng)、血培養(yǎng)等相關(guān)輔助檢查結(jié)果，確定診斷為社區(qū)獲得性肺炎。(5)兒童CAP感染患兒年齡在12歲以下；(6)急性期患者，病程<3 d。(7)病情嚴(yán)重程度均為輕中度。(8)無嚴(yán)重心、肺、肝、腎功能不全。(9)患者知情同意，自愿參加本項(xiàng)研究。排除標(biāo)準(zhǔn)：(1)合并其他病原體的肺部感染；(2)合并其他感染性疾病，如結(jié)核感染，或有結(jié)核病史等；(3)嚴(yán)重心、肺、肝、腎功能不全。(4)無法排除醫(yī)院感染可能性的患者；(5)伴有免疫系統(tǒng)異常疾病的患者；(6)患者及家屬不配合治療，依從性差者。選擇同期在本院體檢中心接受體檢的200例健康受試者作為對照組，男112例，女88例，年齡5～78歲，平均(30.50±5.3)歲。兩組受試者的性別和年齡差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。分離靜脈血血清，于-20 ℃冰箱保存，第1次復(fù)溶后于2～8 ℃冰箱保存，24 h內(nèi)完成試驗(yàn)。

1.2檢測試劑 CPIgG和PCIgM抗體試劑(試劑批號分別為20171205和20171207，亞輝龍生物科技股份有限公司，中國)； CPIgG和CPIgM抗體ELISA試劑盒(試劑批號分別為ZK-H2323和ZK-H2325，美國R&D公司)； CP間接免疫熒光抗體(試劑批號RD455645，美國R&D公司)。

1.3檢測設(shè)備 iFlash 3000化學(xué)發(fā)光免疫分析儀(型號：FA6C-00000A64，亞輝龍生物科技股份有限公司，中國)，Biotek酶標(biāo)儀(型號：CYT50-0000065，Molecular Devices，美國),Mikon E3600熒光顯微鏡。

1.4性能評估方法 參考美國臨床和實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)化研究所(CLSI)[6]制訂的《體外診斷試劑性能分析指導(dǎo)原則》，檢測CPIgG和CPIgM的性能檢驗(yàn)指標(biāo)包括：最低檢出限( LoD)、批內(nèi)精密度、批間精密度、線性范圍以及臨床符合率。

1.4.1最低檢出限 參考CLSI的EP17-A2文件[7]進(jìn)行驗(yàn)證，以評價(jià)該方法的。選擇低濃度梯度樣本5份，重復(fù)測試20次，設(shè)定Ⅱ類錯誤水平β錯5%，若數(shù)據(jù)呈正態(tài)分布，則采用參數(shù)方法估計(jì)LoD，若呈非正態(tài)分布，則采用非參數(shù)方法估計(jì)LoD。

1.4.2精密度 精密度為評價(jià)測量中隨機(jī)誤差程度的指標(biāo)。表達(dá)方式采用變異系數(shù)(CV)，CV越小，精密度越好。參考CLSI的EP5-A文件[8]進(jìn)行驗(yàn)證。批內(nèi)精密度選擇CPIgG和IgM各高低2個(gè)濃度水平的樣本，1 d內(nèi)重復(fù)檢測20次；批間精密度選擇CP-IgG和-IgM各高低2個(gè)濃度水平的樣本，每個(gè)水平每天重復(fù)檢測4次，共檢測5 d。

1.4.3線性評價(jià) 參考CLSI的EP6-A文件[6]進(jìn)行驗(yàn)證，采用已知濃度為3.0、30.0、40.0、50.0、60.0、100.0、200.0 AU/mL的系列標(biāo)準(zhǔn)溶液，分別由測試產(chǎn)品測量。應(yīng)用線性回歸，使用已知濃度繪制數(shù)據(jù)X軸上的樣本和Y軸上的測量平均值，兩軸均以10為底的對數(shù)繪制坐標(biāo)。測試產(chǎn)品的線性范圍。

1.4.4臨床符合率 參考CNAS-CL39文件[9]進(jìn)行驗(yàn)證，選擇確診CP的陰性和陽性標(biāo)本各200例，使用CLIA檢測標(biāo)本的CPIgG和CPIgM抗體。

1.5統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 統(tǒng)計(jì)分析使用SPSS19.0軟件進(jìn)行。線性范圍通過線性回歸分析計(jì)算。不同方法學(xué)之間的一致性程度通過Kappa檢驗(yàn)評估，以P<0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1最低檢出限 測試產(chǎn)品用于測量稀釋的梯度L-系列標(biāo)準(zhǔn)品的濃度并產(chǎn)生標(biāo)準(zhǔn)劑量-反應(yīng)曲線(圖1)。同時(shí)，0 AU/mL標(biāo)準(zhǔn)溶液(空白參考)的樣本在檢測中獨(dú)立檢測20次。最低檢測濃度的平均值為0.009 2 AU/mL，低于0.01 AU/mL。因此，CLIA的LoD為0.01 AU/mL。

圖1 CLIA法的標(biāo)準(zhǔn)劑量-反應(yīng)曲線

2.2精密度 如表1、2所示，CLIA具有2.15%～6.47%的批內(nèi)CV和3.17%～6.18%的批間CV，表明CLSI的結(jié)果具有良好的重復(fù)性。

表1 CLIA檢測CP-IgG抗體的精密度

表2 CLIA檢測CP-IgM抗體的精密度

2.3線性評價(jià) 當(dāng)CPIgG抗體在3.0～200.0 AU/mL時(shí)，擬合曲線為Y=0.937 4X-5.327，R2=0.993 4，驗(yàn)證通過。見表3。

表3 CLIA法檢測CPIgG抗體的線性 評價(jià)實(shí)驗(yàn)結(jié)果(AU/mL)

2.5方法學(xué)之間的一致性

2.5.1采用CLIA和ELISA分別檢測200例樣本的CPIgG和CPIgM抗體，通過Kappa檢驗(yàn)評估，Kappa分別=0.900和0.903(均P<0.001)。一致百分比分別為85.0%和85.5%，見表4、5。

表4 CLIA與ELISA檢測CP-IgG抗體的結(jié)果比較(n)

表5 CLIA與ELISA檢測CP-IgM抗體的結(jié)果比較(n)

2.5.2采用CLIA與IIF以不區(qū)分抗體類型檢測200例樣本的CP抗體，通過Kappa檢驗(yàn)評估，Kappa=0.905(P<0.001)。一致百分比為80.0%，見表6。

表6 CLIA與IIF檢測CP抗體的結(jié)果比較(n)

3 討 論

CP于1986年首次發(fā)現(xiàn)，到1989年，CP被確認(rèn)為沙眼衣原體和鸚鵡熱衣原體之后的第三種衣原體。 CP分布在世界各地，并通過氣溶膠在人群中傳播[10-11]。CP原發(fā)性感染3周后，即可檢測到IgM抗體。在急性或既往感染患者的血清中可以檢測到抗體。臨床一般在第2周，第3周和第6周進(jìn)行進(jìn)一步的測試，以區(qū)分新感染與既往感染或慢性感染。因此，CP感染后抗體的形成慢于其他病原體[12]。CPIgG抗體水平通常在再感染后1～2周升高，但有時(shí)候沒有再感染也會升高。CPIgM抗體水平在再感染時(shí)可能會稍微升高。

大約一半的CP感染患者無癥狀或僅有輕度咽痛。其他CP感染癥狀包括：持續(xù)性干咳、頭痛和發(fā)熱。CP慢性感染在成人中更常見。超過50%成人感染過CP，產(chǎn)生CP抗體。CP感染可誘導(dǎo)特異性T細(xì)胞免疫和B細(xì)胞免疫。抗體可能會暫時(shí)提供一定的免疫保護(hù)，但是其免疫力不夠強(qiáng)，只能保持短暫時(shí)間，這在大多數(shù)情況下不能阻止再次感染反復(fù)發(fā)作。血清流行病學(xué)研究有表明CP感染3～5年后血清抗體會減少或消失[13]。CP特異度IgM和IgG抗體可以在健康者身上檢測到，這表明存在健康的攜帶者。CP是一種常見的人類呼吸系統(tǒng)感染性疾病病原體。近年來，CP被發(fā)現(xiàn)與一些相關(guān)慢性疾病，包括支氣管哮喘、冠心病疾病和動脈粥樣硬化，以及一些比較罕見的疾病，如腦膜炎、心肌炎和格林巴利綜合征有關(guān)。最近的臨床研究也發(fā)現(xiàn)，CP抗體檢測結(jié)果較高的患者更有可能存在多種全身性疾病，包括咽炎、喉炎、鼻炎、鼻竇炎、結(jié)節(jié)病、惡性淋巴瘤、多發(fā)性硬化癥、老年癡呆癥、肺癌、早產(chǎn)和胎膜早破[3-4,13]。CP已成為一種嚴(yán)重危害人類的病原體，因此引起越來越多的學(xué)者的關(guān)注。

《醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)室質(zhì)量和能力認(rèn)可準(zhǔn)則》中規(guī)定，對開展某一新的檢測項(xiàng)目，更換檢測系統(tǒng)或儀器或改變檢測試劑盒生產(chǎn)商時(shí)，實(shí)驗(yàn)室需要對其相關(guān)方法學(xué)分析性能予以驗(yàn)證，對廠商提供的評價(jià)資料中的主要性能予以確認(rèn)。因此，本研究根據(jù)由CLSI制訂的《體外診斷試劑性能分析指導(dǎo)原則》，在檢測CPIgG和CPIgM的性能檢驗(yàn)指標(biāo)選擇最低檢出限、批內(nèi)精密度、批間精密度、線性范圍以及臨床符合率。CLSI檢測CPIgG的最低檢測限為0.01 AU/mL，臨床應(yīng)用可接受。CLSI檢測CPIgG與CPIgM的批內(nèi)、批間精密度較小，表明CLSI檢測CP分型抗體的結(jié)果具有良好的重復(fù)性。CLIA檢測CPIgG抗體在3.0～200.0 AU/mL線性范圍內(nèi)，擬合曲線符合R2≥0.990，0.85

根據(jù)一致性強(qiáng)度的判定標(biāo)準(zhǔn)：Kappa值為正數(shù)，而且Kappa值越大，一致性越好。Kappa≥0.75，表明一致性良好；0.40≤Kappa<0.75，表明一致性一般；Kappa<0.40，表明一致性較差[14]。本研究結(jié)果顯示，CLIA和ELISA檢測CPIgG和CPIgM抗體的Kappa分別為0.900和0.903。一致百分比分別為85.0%和85.5%，表明CLIA和ELISA檢測CPIgG和CPIgM抗體的一致性較好。另外，CLIA與ELISA檢測CPIgG及CPIgM抗體陽性率結(jié)果存在差異，其原因可能主要來源于不同季節(jié)、不同人群以及患者處在不同的感染階段，均可導(dǎo)致陽性率的差異。此外，CLIA和IIF檢測CP抗體的Kappa為0.905(P<0.001)。一致百分比為80.0%，表明CLIA和ELISA檢測CP抗體也具有較好的一致性。

自發(fā)明以來，CLIA已廣泛應(yīng)用于臨床診斷和環(huán)境分析[15]。在最初階段，CLIA通常使用化學(xué)發(fā)光指示劑[16]，如異魯米諾，吖啶酯等，直接標(biāo)記抗原(抗體)。盡管CLIA技術(shù)提高了免疫分析的靈敏度，化學(xué)發(fā)光的直接標(biāo)記指標(biāo)受到相對較短的發(fā)光持續(xù)時(shí)間的限制，所以它的應(yīng)用需要機(jī)器來協(xié)助。因此，近年來發(fā)明了基于化學(xué)發(fā)光的酶-抗體綴合物底物和發(fā)光計(jì)用于測量抗體的水平，具有較高的靈敏度和更大的檢測線性范圍[17-23]。

4 結(jié) 論

CLIA檢測CP抗體的各項(xiàng)指標(biāo)符合生產(chǎn)廠家的聲明和臨床要求。CLIA法具有操作簡便、靈敏度高、特異度強(qiáng)、精密度高、檢測范圍寬等優(yōu)點(diǎn)，臨床上可以替代ELISA和IIF用于CP抗體的檢測。