187例介入性產(chǎn)前診斷雙胎的染色體核型和染色體微陣列結(jié)果分析

胡晶晶,蔡嬋慧,張憶聰,李 星,許 玲,劉 淵,李顯箏

(廣東省婦幼保健院醫(yī)學(xué)遺傳中心，廣東廣州 511442)

隨著二孩政策的放開(kāi)、促排卵藥的運(yùn)用以及輔助生殖技術(shù)的不斷進(jìn)步，我國(guó)雙胎妊娠的發(fā)生率逐年提高。雙胎妊娠作為一種特殊的高危妊娠，其出生缺陷率、死亡率、流產(chǎn)率、早產(chǎn)率、染色體異常和其特有的母胎并發(fā)癥發(fā)生率均較單胎妊娠要高[1]。據(jù)原國(guó)家衛(wèi)生和計(jì)劃生育委員會(huì)公益性行業(yè)項(xiàng)目10家參加單位的統(tǒng)計(jì)結(jié)果顯示，雙胎的出生缺陷率約為6.3%[2]。同時(shí)，雙胎妊娠較單胎妊娠的產(chǎn)前篩查和產(chǎn)前診斷的準(zhǔn)確性差，其咨詢難度也更大。在檢測(cè)染色體異常的方法中，目前染色體G顯帶核型分析仍然是金標(biāo)準(zhǔn)，染色體微陣列分析(CMA)能夠在全基因組水平檢測(cè)染色體不平衡的拷貝數(shù)變異(CNV)，尤其是對(duì)于檢測(cè)染色體組微小缺失、重復(fù)等不平衡性重排具有突出優(yōu)勢(shì)[3-4]。本文擬將在本院近3年來(lái)進(jìn)行介入性產(chǎn)前診斷雙胎的染色體和染色體微陣列結(jié)果進(jìn)行回顧性分析和總結(jié)。

1 資料與方法

1.1一般資料 2015年4月至2017年12月在本院醫(yī)學(xué)遺傳中心進(jìn)行介入性產(chǎn)前診斷的雙胎孕婦187例(374個(gè)胎兒)，孕婦年齡16～49歲，平均32歲。術(shù)前孕婦均已簽署知情同意書(shū)。按孕婦不同孕周選擇不同的穿刺手術(shù)，其中孕11～14周行絨毛穿刺術(shù)14例(28個(gè)胎兒)，孕16～25周行羊膜腔穿刺術(shù)153例(306個(gè)胎兒)和孕25～31周臍血穿刺術(shù)20例(40個(gè)胎兒)，并分別將獲得的絨毛、羊水和臍血共計(jì)374個(gè)胎兒樣本進(jìn)行染色體G顯帶和染色體微陣列分析。按介入性指征統(tǒng)計(jì)，因單純高齡(≥35歲)、唐篩高風(fēng)險(xiǎn)或者高齡合并唐篩高風(fēng)險(xiǎn)而進(jìn)行介入性產(chǎn)前診斷雙胎孕婦25例；因NIPT高風(fēng)險(xiǎn)而進(jìn)行介入性產(chǎn)前診斷雙胎孕婦10例；因超聲發(fā)現(xiàn)胎兒結(jié)構(gòu)異常(包括雙胎和雙胎之一結(jié)構(gòu)畸形和軟指標(biāo)異常)而進(jìn)行介入性產(chǎn)前診斷雙胎孕婦140例；因父母雙方之一染色體異常而進(jìn)行介入性產(chǎn)前診斷雙胎孕婦7例；因不良生育史而進(jìn)行介入性產(chǎn)前診斷雙胎孕婦5例。按妊娠方式統(tǒng)計(jì)，自然妊娠77例，孕婦平均年齡31歲；輔助妊娠97例，孕婦平均年齡33歲；另13例妊娠方式未記錄。按胎兒絨毛膜性統(tǒng)計(jì)，雙絨毛膜雙羊膜囊雙胎(DCDA)145例，單絨毛膜雙羊膜囊雙胎(MCDA)40例，絨毛膜性不詳2例，每個(gè)胎兒均分別取樣。

1.2方法

1.2.1染色體G顯帶分析 將B超引導(dǎo)下穿刺獲得的絨毛(20～30 mg)、羊水(20 mL)和臍帶血(1 mL)用于體外培養(yǎng)，其中絨毛和羊水為原位培養(yǎng)，臍血直接接種入3瓶培養(yǎng)基懸浮培養(yǎng)。經(jīng)收獲、吉姆薩染色制片。在顯微鏡下，絨毛和羊水計(jì)數(shù)15～20個(gè)克隆，每個(gè)克隆分析1～2個(gè)核型；臍帶血計(jì)數(shù)20個(gè)核型，至少分析5個(gè)核型,如有嵌合則增加計(jì)數(shù)至100個(gè)核型。結(jié)果依據(jù)人類細(xì)胞基因組學(xué)國(guó)際命名體系(ISCN 2013)對(duì)染色體核型進(jìn)行命名。絨毛和羊水的G顯帶分辨率為350～420條帶，臍帶血G顯帶分辨率為550條帶[5-7]。

1.2.2CMA 將B超引導(dǎo)下穿刺獲得的絨毛(50～100 μg)、羊水(5 mL)和臍帶血(0.3 mL)用于提取基因組DNA。使用美國(guó)Affymatrix公司的CytoScan 750k芯片，按照該公司提供的標(biāo)準(zhǔn)化操作流程完成全部檢測(cè)(DNA的提取、酶切、連接、PCR、PCR產(chǎn)物純化、定量、片段化、標(biāo)記、雜交、洗滌、染色和掃描)，得到數(shù)據(jù)后經(jīng)ChAS3.1.0.15軟件進(jìn)行結(jié)果分析,最終結(jié)果判讀參照OMIM、UCSC、ISCA、DGV、DECIPHER等數(shù)據(jù)庫(kù)。

2 結(jié) 果

2.1染色體G顯帶分析結(jié)果 187例雙胎孕婦的胎兒染色體G顯帶分析結(jié)果中，正常核型155例，多態(tài)性核型6例，異常核型26例，除多態(tài)性核型外的異常率為13.90%(26/187)，其中雙胎之一胎核型異常21例(80.77%,21/26)，雙胎核型均異常5例(19.23%,5/26)。

374個(gè)胎兒染色體G顯帶分析結(jié)果共檢出335個(gè)正常核型胎兒，8個(gè)多態(tài)性核型胎兒，31個(gè)異常核型胎兒，除多態(tài)性核型外的異常率為8.29%(31/374)。

異常核型中以染色體數(shù)目異常最多見(jiàn)，有19個(gè)，占異常核型的61.29%(19/31)；嵌合體4個(gè)(12.90%，4/31)；結(jié)構(gòu)異常10個(gè)，占異常核型的32.26%(10/31)，胎兒異常核型分類見(jiàn)表1。具體核型結(jié)果見(jiàn)表2。

表1 31個(gè)異常核型胎兒的核型分類

注：“-”表示無(wú)數(shù)據(jù)

2.2187例雙胎孕婦的胎兒CMA結(jié)果中，共計(jì)異常有31例，異常率16.58%。31例異常結(jié)果中發(fā)現(xiàn)數(shù)目異常16例，嵌合體異常3例，結(jié)構(gòu)異常12例。

374個(gè)胎兒CMA結(jié)果中，共計(jì)有36個(gè)異常，異常率9.63%(36/374)。36個(gè)異常結(jié)果中發(fā)現(xiàn)數(shù)目異常18個(gè)(50%，18/36)，嵌合體遺產(chǎn)3個(gè)(8.33%，3/36)，結(jié)構(gòu)異常15個(gè)(41.67%，15/36)。15個(gè)CMA結(jié)構(gòu)異常胎兒中發(fā)現(xiàn)雜合性缺失2個(gè)；微缺失或微重復(fù)13個(gè)，其中有7例是致病性拷貝數(shù)變異(pCNV )，5例為臨床意義不明CNVs，1例為良性CNVs。胎兒MA異常結(jié)果分類見(jiàn)表3。在染色體核型正常的343個(gè)胎兒中，共檢出CMA異常胎兒11個(gè)，額外檢出率為3.21%(11/343)。

聯(lián)合兩種檢測(cè)方法結(jié)果，374個(gè)胎兒中共檢測(cè)出異常胎兒42個(gè)，總異常率11.23%(42/374)，其中染色體G顯帶和CMA均異常胎兒25個(gè)占6.68%(25/374)，染色體G顯帶異常而CMA正常胎兒6個(gè)占1.60%(6/374)，染色體G顯帶正常而CMA異常胎兒11個(gè)占2.94%(11/374)。具體異常染色體G顯帶和CMA見(jiàn)表2。

表2 胎兒異常染色體G顯帶和CMA結(jié)果

續(xù)表2 胎兒異常染色體G顯帶和CMA結(jié)果

表3 36個(gè)胎兒CMA異常結(jié)果分類

3 討 論

目前，雙胎妊娠的非整倍體異常還沒(méi)有最佳的篩查方案。據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，唐氏綜合征在雙胎妊娠孕中期血清學(xué)篩查的檢出率為45%，其假陽(yáng)性率為10%[8]，因此，不建議對(duì)雙胎妊娠進(jìn)行單獨(dú)的血清學(xué)篩查。近年來(lái)，隨著NIPT在產(chǎn)前篩查中的廣泛應(yīng)用，NIPT在雙胎妊娠產(chǎn)前篩查中的應(yīng)用效果雖然明顯優(yōu)于傳統(tǒng)血清學(xué)篩查，但其檢出率也僅可達(dá)到93.7%[9]。因此，對(duì)于有指征的雙胎孕婦進(jìn)行介入性產(chǎn)前診斷顯得非常重要。

本研究成功對(duì)有指征的184例雙胎孕婦進(jìn)行介入性穿刺手術(shù)共取得374個(gè)胎兒樣本。在374個(gè)胎兒中，染色體G顯帶核型分析的異常率為8.29%(31/374)，CMA的異常率為9.63%(36/374)，在染色體核型正常的343個(gè)胎兒中，共檢出CMA異常胎兒11個(gè)，額外檢出率為3.21%(11/343)。據(jù)現(xiàn)有文獻(xiàn)報(bào)道，CMA對(duì)染色體核型正常的產(chǎn)前樣本檢測(cè)的額外檢出率達(dá)到0.8%～5.5%[10-13]。盡管如此，相對(duì)于G顯帶核型分析技術(shù)，CMA也有其不足：(1)不能檢測(cè)平衡易位、倒位等平衡性染色體重排異常；(2)不能檢測(cè)出四倍體和低比例嵌合，對(duì)于異常細(xì)胞≥30%的嵌合體檢測(cè)結(jié)果比較可靠[4]。(3)不能檢測(cè)出探針未覆蓋的染色體區(qū)域異常，如異染色質(zhì)區(qū)和隨體區(qū)域。在本研究中，有7例11個(gè)胎兒(病例3、19、22、24、25、26、27)的G顯帶核型結(jié)果異常而CMA未檢出明確異常?？梢?jiàn)，兩種方法可以相輔相成，以各自的優(yōu)點(diǎn)彌補(bǔ)對(duì)方的缺點(diǎn)，提高胎兒染色體異常的檢出率。

本研究中共檢測(cè)出2例2個(gè)胎兒(病例4胎A和病例31胎A)的LOH，其是否有致病性還有待進(jìn)一步研究。在本研究中，還檢測(cè)出13個(gè)胎兒有CNV，其中包括1個(gè)部分單體和部分三體胎兒(病例3胎A)、7個(gè)微重復(fù)和5個(gè)微缺失胎兒；在13個(gè)有CNV的胎兒中，7個(gè)是pCNV，5個(gè)為臨床意義不明CNVs，1個(gè)為良性CNVs。對(duì)于7個(gè)pCNV胎兒的遺傳咨詢，需向孕婦及家屬充分告知胎兒不良結(jié)局的可能。而對(duì)于5個(gè)為臨床意義不明CNVs胎兒的遺傳咨詢，由于目前還缺少相關(guān)數(shù)據(jù)的支持，也應(yīng)該向孕婦及家屬充分告知該檢測(cè)結(jié)果的局限性，最好建議胎兒父母雙方做染色體微陣列檢測(cè)以明確該CNVs是否遺傳自父母雙方之一，這對(duì)胎兒預(yù)后的判斷會(huì)有非常重要的幫助。

本研究中，發(fā)現(xiàn)兩例(病例18和22)單絨毛膜雙胎兩個(gè)胎兒的染色體核型不一致。其中病例18胎A核型結(jié)果為45,X，CMA結(jié)果為arr(1-22)×2,(X)×1，胎B核型結(jié)果為46,XX，CMA結(jié)果為arr(1-22,X)×2；病例22胎A核型結(jié)果為mos 46,XY,i(20)(q10)[14]/46,XY[14]，CMA結(jié)果為arr(1-22)×2,(X,Y)×1，胎B核型結(jié)果為46,XY，CMA結(jié)果為arr(1-22)×2,(X,Y)×1。理論上，單絨毛膜雙胎兩個(gè)胎兒由一個(gè)受精卵發(fā)育而來(lái)，遺傳物質(zhì)應(yīng)該相同，但事實(shí)上并非如此。目前國(guó)內(nèi)外均有報(bào)道單絨毛膜雙胎兩個(gè)胎兒染色體不一致[14-15]。這種不一致的情況可以是性染色體非整倍體異常，也可以是常染色體非整倍體異常，其中以特納綜合征最常見(jiàn)。這種不一致的異?？梢允菃渭兊姆钦扼w異常，也可以是嵌合型的非整倍體異常。有報(bào)道，單卵雙胎出現(xiàn)一胎染色體(基因)異常的概率約為10%，遠(yuǎn)高于雙卵雙胎和單胎妊娠 (1%～2%) 。其發(fā)生機(jī)制可能為合子在分裂前即處于染色體嵌合狀態(tài)、受精卵在分裂為雙胎時(shí)其中一胎發(fā)生染色體不分離、合子分裂后基因突變、X染色體失活偏離、基因組印記改變、 基因的甲基化或組蛋白修飾[16]，但其確切機(jī)制還需要深入的研究。

4 結(jié) 論

由于雙胎妊娠的產(chǎn)前篩查較單胎的產(chǎn)前篩查準(zhǔn)確性低，雙胎妊娠又由于其自身的特殊性，其發(fā)生出生缺陷的風(fēng)險(xiǎn)較單胎妊娠高且復(fù)雜，產(chǎn)前診斷和遺傳咨詢難度也更大。因此，對(duì)于有指征的雙胎，應(yīng)更嚴(yán)格地進(jìn)行介入性產(chǎn)前診斷，最好是在進(jìn)行染色體核型分析的同時(shí)進(jìn)行CMA檢測(cè)，利用兩種方法的優(yōu)點(diǎn)相互彌補(bǔ)對(duì)方的缺點(diǎn)，盡可能地提高染色體異常的檢出率，減少出生缺陷的發(fā)生。