自身抗體對(duì)乙型肝炎病毒相關(guān)性腎炎的診斷和預(yù)測(cè)價(jià)值

耿麗娜,張璧珠,李寶亮

(河北北方學(xué)院附屬第一醫(yī)院檢驗(yàn)科，河北張家口 075000)

乙型肝炎病毒(HBV)感染在全球范圍分布廣泛，其中發(fā)展中國(guó)家感染率較高，據(jù)報(bào)道我國(guó)HBV攜帶率高達(dá)10%～20%[1]。HBV感染除了引起肝臟病變外，還可導(dǎo)致全身多器官疾病，其中腎小球腎炎較為常見。1971年，COMBES等[2]首次發(fā)現(xiàn)HBV感染與膜性腎病有關(guān)，掀起了國(guó)內(nèi)外研究HBV感染與腎臟疾病關(guān)系的浪潮。直到1989年在我國(guó)召開的乙型肝炎病毒相關(guān)性腎炎座談會(huì)上，正式將該病命名為乙型肝炎病毒相關(guān)性腎炎(HBV-GN)，是指由HBV直接或間接誘發(fā)的腎小球腎炎，經(jīng)血清免疫學(xué)及腎活檢免疫熒光所證實(shí)，并除外與腎臟疾病相關(guān)、病因明確的其他繼發(fā)性腎小球腎炎(如狼瘡性腎炎)的一種疾病[3]。我國(guó)HBV攜帶者中HBV-GN的發(fā)生率較高，約為6.8%～20%[4]。已有研究報(bào)道在狼瘡腎炎中自身抗體具有一定的診斷價(jià)值[5-6]，并且另有研究發(fā)現(xiàn)在HBV-GN中自身抗體有一定的增高，但尚未有研究揭示自身抗體在HBV-GN中的診斷和預(yù)測(cè)價(jià)值。由于感染HBV的患者中HBV-GN發(fā)病率較高，目前可預(yù)測(cè)疾病的指標(biāo)較少，所以本研究著眼于探索有助于預(yù)測(cè)HBV-GN發(fā)病的免疫學(xué)指標(biāo)——自身抗體，為此病的早期診斷和預(yù)防提供有價(jià)值的信息。

1 資料與方法

1.1一般資料 納入研究者為2015年8月至2017年7月于河北北方學(xué)院附屬第一醫(yī)院首次就診患者，分組及入選標(biāo)準(zhǔn)如下。(1)HBV-GN組：23例，診斷標(biāo)準(zhǔn)依據(jù)1989年HBV-GN座談會(huì)上制定的標(biāo)準(zhǔn)[3]。血清HBV抗原陽(yáng)性；患腎小球腎炎，并排除狼瘡性腎炎等繼發(fā)性腎小球疾病；腎切片上找到HBV抗原。入組的所有患者臨床癥狀和實(shí)驗(yàn)室診斷均未達(dá)到自身免疫病的診斷標(biāo)準(zhǔn)：首先患者病史無(wú)自身免疫病，其次患者均未表現(xiàn)出自身免疫病的臨床癥狀，再次患者外周血免疫球蛋白、紅細(xì)胞沉降率(ESR)和C-反應(yīng)蛋白(CRP)結(jié)果均未表現(xiàn)出異常，但部分患者補(bǔ)體水平降低，可能與形成的免疫復(fù)合物有關(guān)。(2)HBV非GN組：25例，血清乙型肝炎病毒表面抗原(HBsAg)陽(yáng)性，經(jīng)病理切片檢查和血清學(xué)檢測(cè)已排除相關(guān)腎小球腎炎。(3)健康對(duì)照組25例，血清HBsAg陰性，無(wú)腎小球腎炎和其他相關(guān)自身免疫性疾病的體檢健康者。HBV-GN組男19例、女4例；平均年齡25歲；經(jīng)實(shí)驗(yàn)室檢查所有患者血清HBsAg均為陽(yáng)性，24 h尿蛋白均在3.5 g以上，且腎組織切片中乙肝抗原(HBsAg或HBcAg)陽(yáng)性；病理類型顯示其中膜性腎病17例，膜增生型腎小球腎炎5例，系膜增生型腎小球腎炎1例。HBV非GN組男19例、女6例，平均年齡為28歲;經(jīng)實(shí)驗(yàn)室檢查所有病例血清HBsAg均為陽(yáng)性且24 h尿蛋白均低于3.5 g，腎組織切片乙肝抗原為陰性。健康組男18例、女7例，平均年齡為26歲;經(jīng)實(shí)驗(yàn)室檢查血清HBsAg均為陰性，24 h尿蛋白均低于3.5 g，腎組織切片乙肝抗原均為陰性。

本研究經(jīng)醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，所有受試者在研究開始前簽署知情同意書。

1.2主要儀器 全自動(dòng)間接免疫熒光操作/酶聯(lián)免疫一體機(jī)：Sprinter XL；全自動(dòng)免疫印跡儀：EUROBlotMaster Ⅱ-50；熒光顯微鏡：EUROStar Ⅲ Plus。

1.3方法 臨床上檢測(cè)自身抗體有多種方法，其中最重要和最常用的是間接免疫熒光法檢測(cè)抗核抗體和免疫印跡法檢測(cè)抗可溶性核抗原(ENA)抗體譜。采用間接免疫熒光法檢測(cè)血清抗核抗體(ANA)，滴度>1∶100為陽(yáng)性，具體操作步驟如下：(1)將血清樣本稀釋100倍，滴加25 μL稀釋后樣本至加樣板，與載片覆有生物薄片的一面接觸，室溫溫育30 min；(2)用PBS吐溫緩沖液流水沖洗載片，立即將其浸入裝有PBS吐溫緩沖液的燒杯中浸泡至少5 min；(3)滴加20 μL FITC標(biāo)記的抗人IgG至潔凈的加樣板，將浸泡后的載片蓋在加樣板上與抗人IgG接觸，室溫溫育30 min；(4)重復(fù)步驟(2)；(5)滴加約10 μL封片介質(zhì)至蓋玻片，將浸泡后的載片蓋在蓋玻片上，顯微鏡下觀察熒光模型。

免疫印跡法檢測(cè)血清自身抗體譜，包括nRNP、Sm、SS-A、Ro-52、SS-B、Scl-70、PM-Scl、Jo-1、CENP B、PCNA、dsDNA、核小體、組蛋白、核糖體P蛋白和AMA-M2等14種不同抗原的IgG類抗體。具體操作步驟如下：(1)將膜條放入溫育槽內(nèi)，加入1.5 mL樣本緩沖液，在搖床上溫育5 min后吸去溫育槽中的液體；(2)在溫育槽中加入1.5 mL稀釋100倍的血清樣本，在搖床上室溫溫育30 min；(3)吸去槽內(nèi)液體，用1.5 mL清洗緩沖液清洗膜條3次，每次5 min；(4)在槽內(nèi)加入1.5 mL酶結(jié)合物，搖床上室溫溫育30 min；(5)重復(fù)步驟(3)；(6)在槽中加入1.5 mL底物液，搖床上室溫溫育10 min；(7)吸去槽內(nèi)液體，用蒸餾水清洗膜條3次，每次1 min；(8)將膜條放在結(jié)果判定模板中，風(fēng)干后判斷結(jié)果。

以上試劑均來(lái)自于德國(guó)歐蒙醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)診斷有限公司，所有步驟均根據(jù)說明書嚴(yán)格執(zhí)行。

2 結(jié) 果

2.1HBV-GN組、HBV非GN組及健康組間ANA和抗ENA抗體譜陽(yáng)性率分析 檢測(cè)HBV-GN組、HBV非GN組及健康組血清中ANA和抗ENA抗體譜，分別對(duì)3組間ANA和抗ENA抗體譜陽(yáng)性率進(jìn)行比較。結(jié)果顯示，與HBV非GN組和健康組相比，HBV-GN組ANA以及抗ENA抗體譜陽(yáng)性率均顯著增高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。其中HBV-GN組ANA和抗ENA抗體譜雙陽(yáng)性的樣本為8例，HBV非GN組ANA和抗ENA抗體譜雙陽(yáng)性的樣本為2例，見表1。

表1 3組ANA和抗ENA抗體譜陽(yáng)性率分析[n(%)]

注：HBV-GN組與HBV非GN組比較，aP<0.01；HBV-GN組與健康組比較，bP<0.01

2.2ANA核型及抗ENA抗體譜分析 經(jīng)過分析實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)，本文發(fā)現(xiàn)HBV-GN組ANA核型主要為核顆粒型(47.8%)，其次為胞漿顆粒型(13.0%)，抗ENA抗體譜主要為Ro-52(17.5%)和AMA-M2(17.5%)；HBV非GN組ANA同樣以核顆粒型為主(16%),見表2。

表3 HBV-GN和HBV非GN組ANA核型和抗ENA抗體譜陽(yáng)性率分析[n(%)]

2.3HBV非GN組自身抗體陽(yáng)性更易發(fā)生HBV-GN 為研究自身抗體與乙肝患者發(fā)生HBV-GN的關(guān)系，本文對(duì)HBV-非GN組進(jìn)行了為期12個(gè)月的隨訪，結(jié)果發(fā)現(xiàn)7例自身抗體陽(yáng)性患者中有5例發(fā)生了HBV-GN，而自身抗體陰性患者中無(wú)1例發(fā)生(圖1，P=0.000)。

圖1 HBV-GN發(fā)生率曲線

3 討 論

多數(shù)腎小球腎炎是由免疫介導(dǎo)的炎癥疾病，其中繼發(fā)性腎炎最常見的是HBV-GN和系統(tǒng)性紅斑狼瘡腎炎。許多研究已發(fā)現(xiàn)系統(tǒng)性紅斑狼瘡的病理性自身抗體參與了狼瘡腎炎的發(fā)病，且有助于疾病的診斷[5-6]，但目前尚未有研究報(bào)道自身抗體在HBV-GN的臨床應(yīng)用，筆者在本研究中首次探討了自身抗體在乙型肝炎相關(guān)性腎炎中的預(yù)測(cè)和早期診斷價(jià)值。自身抗體現(xiàn)已廣泛應(yīng)用于多種自身免疫性疾病或自身免疫功能紊亂相關(guān)性疾病的臨床診斷及預(yù)后判斷[7-9]。CACOUB等[10]發(fā)現(xiàn)HBV感染人體細(xì)胞后可以誘發(fā)自身免疫反應(yīng)，繼而產(chǎn)生多種自身抗體，LEI等[11]發(fā)現(xiàn)慢性HBV感染患者ANA和ENA陽(yáng)性率達(dá)65%，張曉紅等[12]發(fā)現(xiàn)慢性乙肝患者血清ANA陽(yáng)性率為16.7%，以上研究表明有相當(dāng)一部分乙肝患者體內(nèi)存在自身抗體，但有很少研究關(guān)注增高的自身抗體對(duì)乙肝患者的預(yù)后產(chǎn)生哪些影響。

本研究發(fā)現(xiàn)HBV-GN患者與HBV非GN患者相比，血清抗核抗體和抗ENA抗體譜陽(yáng)性率顯著增高，分別高達(dá)73.9%和43.5%，于是本文認(rèn)為自身抗體是否與乙肝患者發(fā)生腎炎有關(guān)。腎臟可以通過多種機(jī)制成為自身抗體的受害者，自身抗體可損傷腎小球或腎組織特異性抗原，如膜性腎病[13]，抗腎小球基底膜腎炎[14]和IgA腎病[15]等。有研究發(fā)現(xiàn)[16]，免疫復(fù)合物可以改變腎臟基底膜的結(jié)構(gòu)，激活補(bǔ)體的經(jīng)典路徑，加劇C3a和C5a等趨化因子的炎癥過程，另外由于C5b-9復(fù)合物的細(xì)胞溶解作用，補(bǔ)體末端通路也會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞損傷。以上研究表明增高的自身抗體可致腎臟損傷，引起一系列腎臟疾病。

本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，有28%的乙肝非腎炎患者血清自身抗體陽(yáng)性，本文認(rèn)為可能這部分患者尚未發(fā)生HBV-GN或因其他某些原因尚未致病。為了證實(shí)乙肝患者發(fā)生HBV-GN是否與自身抗體有關(guān)，本文對(duì)25例乙肝非腎炎患者進(jìn)行了為期1年的隨訪，發(fā)現(xiàn)7例自身抗體陽(yáng)性的乙肝患者在1年內(nèi)有5例發(fā)生了HBV-GN，并且自身抗體陰性的患者無(wú)1例發(fā)生HBV-GN。以上結(jié)果均表明自身抗體在HBV-GN的預(yù)測(cè)和早期診斷中可能具有重要的意義，故對(duì)自身抗體陽(yáng)性的乙肝患者進(jìn)行定期監(jiān)測(cè)或提早干預(yù)，有利于預(yù)防乙肝患者HBV-GN的發(fā)生。另外2例自身抗體陽(yáng)性的乙肝患者可能因隨訪時(shí)間較短或自身抗體轉(zhuǎn)陰而未發(fā)生腎炎，筆者將對(duì)病例繼續(xù)跟蹤。

4 結(jié) 論

綜合本次研究的結(jié)果，HBV-GN患者比HBV非GN患者自身抗體陽(yáng)性率增高，且自身抗體陽(yáng)性的乙肝患者比自身抗體陰性的乙肝患者更易發(fā)生HBV-GN，說明自身抗體在HBV-GN疾病中有一定的預(yù)測(cè)價(jià)值。對(duì)自身抗體陽(yáng)性的乙肝患者進(jìn)行早期干預(yù)，可能會(huì)減少 HBV-GN的發(fā)生，具體干預(yù)方法有待進(jìn)一步研究。