無精及嚴(yán)重少精癥患者Y染色體微缺失類型與不同分型下性激素水平差異分析

林 靜,梁權(quán)輝,朱嫦琳,李煒煊

(佛山市第一人民醫(yī)院檢驗(yàn)科，廣東佛山 528000)

關(guān)于男性不育，世界衛(wèi)生組織將其定義為夫婦同居1年以上且性生活期間未采取任何避孕措施，由男方因素所致的女性不孕[1]。影響男性不育的因素眾多，諸如性功能正常與否、輸精管是否暢通、精子優(yōu)良程度均為引發(fā)該病癥的因素，以最后一個因素最為常見[2-3]。現(xiàn)有研究指出，遺傳缺陷為精子質(zhì)量較差的重要誘因，而Y染色體微缺失在所有遺傳因素中占有重要的地位[4]。隨著以試管嬰兒、卵泡漿內(nèi)單精子注射技術(shù)為代表的輔助生殖技術(shù)日臻成熟，對于基因缺陷引起的男性不育不再是一個不可解決的問題[5]，所以圍繞Y染色體微缺失展開的研究成為一個全新的熱點(diǎn)議題。本次研究圍繞無精及嚴(yán)重少精癥患者Y染色體微缺失類型與不同分型下性激素水平差異予以分析，探討Y染色體微缺失檢測在輔助生殖及治療中的運(yùn)用價(jià)值。

1 資料與方法

1.1一般資料 選取本院2017年1月至2018年5月收治的293例無精及嚴(yán)重少精癥患者為研究對象，在患者知情同意下實(shí)施Y染色體AZF檢測，依據(jù)檢測結(jié)果分為Y染色體微缺失組21例及Y染色體無微缺失組293例。Y染色體微缺失組患者年齡23～45歲，平均(30.14±6.26)歲；病程時間1.5～5年，平均(2.34±0.16)年；病癥類型：無精癥5例、嚴(yán)重少精癥16例。Y染色體無微缺失組患者年齡22～44歲，平均(29.20±5.24)歲；病程時間1.2～5年，平均(2.58±0.20)年；病癥類型：無精癥89例、嚴(yán)重少精癥183例，均自愿參與本研究并簽署知情同意書。納入標(biāo)準(zhǔn)：(1)根據(jù)世界衛(wèi)生組織發(fā)布的《男性實(shí)驗(yàn)室檢測手冊》，無精子癥患者符合連續(xù)2次精液分析并離心后在沉淀中均未發(fā)現(xiàn)精子；嚴(yán)重少精子癥患者符合連續(xù)2次精液分析結(jié)果為精子密度<5×106/mL；(2)染色體核型正常者。排除標(biāo)準(zhǔn)：(1)弱精子癥、精子無力癥、精子數(shù)正常性不育者；(2)生理性不育者；(3)其他病理原因?qū)е碌哪行圆挥?。兩組無精及嚴(yán)重少精癥患者在年齡等一般資料上比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

1.2方法

1.2.1Y染色體AZF檢測方法 紫色EDTA抗凝管采集患者外周靜脈血2 mL，操作流程：(1)提取外周血細(xì)胞基因組DNA。(2)實(shí)時熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)試劑配制。(3)PCR擴(kuò)增。檢測方法PCR，采用熒光探針進(jìn)行多重PCR擴(kuò)增，具體檢測缺失位點(diǎn)為：AZFa(sY84，sY86)，AZFb(sY127，sY134)，AZFc(sY254，sY255)，AZFa，AZFb，AZFc為3個獨(dú)立的檢測區(qū)域，對應(yīng)5種缺失模式，分別為AZFa，AZFb，AZFc，AZF(b+c)，AZF(a+b+c)，試劑盒由上海透景生命科技有限公司提供，所有步驟均嚴(yán)格按照試劑盒內(nèi)說明書要求進(jìn)行。使用的儀器設(shè)備為Applied Biosystems ABI 7500型定量PCR儀(Biolytic美國)，對4個通道熒光(FAM /VIC/ROX/Cy5)同時進(jìn)行檢測。

1.2.2性激素水平檢測方法 黃色凝膠促凝管采集患者空腹靜脈血4 mL并以3 000 r/min離心15 min，收集血清后以電化學(xué)發(fā)光法進(jìn)行性激素水平的測定，儀器設(shè)備為德國西門子拜耳公司生產(chǎn)的ADVIA Centaur XP全自動化學(xué)發(fā)光免疫分析儀，各指標(biāo)生物參考區(qū)間:FSH 1.00～7.00(IU/L)，LH 1.00～8.00(IU/L)，T 9.10～46.20(mmol/L)。

1.3觀察指標(biāo) 選取Y染色體微缺失位點(diǎn)和不同缺失模式以及性激素FSH、LH、T水平為觀察指標(biāo)。

2 結(jié) 果

2.1無精及嚴(yán)重少精癥患者Y染色體微缺失位點(diǎn)和缺失模式構(gòu)成 293例無精及嚴(yán)重少精癥患者中Y染色體微缺失21例(7.17%)，缺失類型包括AZFc缺失12例(57.14%)、AZFa缺失2例(9.52%)、AZF(b+c)缺失4例(19.05%)、AZF(a+b+c)缺失3例(14.29%)，AZFc區(qū)缺失率最高，次之AZFb，AZFa最低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=16.645，P<0.05)。見表1。

2.2Y染色體微缺失與性激素的關(guān)系

2.2.1兩組患者性激素水平比較 兩組FSH、LH、T相比較，Y染色體微缺失組FSH高于Y染色體無微缺失組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，LH、T差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，見表2。

表1 Y染色體微缺失位點(diǎn)和缺失模式例數(shù)及頻率

表2 兩組患者性激素水平比較

2.2.2Y染色體微缺失組內(nèi)不同分型患者性激素水平比較 Y染色體微缺失組內(nèi)不同分型患者性激素水平相比較，F(xiàn)SH和LH水平由高至低均依次為，AZF(a+b+c)缺失、AZF(b+c)缺失、AZFa缺失、AZFc缺失，AZF(a+b+c)缺失模式水平升高最為顯著，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，T水平差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，見表3。

表3 Y染色體微缺失組內(nèi)不同分型患者性激素 水平比較

3 討 論

根據(jù)流行病學(xué)調(diào)查，目前全球范圍內(nèi)出現(xiàn)不育的育齡夫婦占比約為10%～15%，而在此其中約有半數(shù)是由男方因素所致[6-7]。既往臨床認(rèn)為核型異常、內(nèi)分泌功能紊亂、長期接觸環(huán)境毒物、生殖道病變、精索靜脈曲張、睪丸等因素是導(dǎo)致男性不育的主要原因，但隨著細(xì)胞遺傳學(xué)以及分子生物學(xué)內(nèi)容的不斷拓展，位于Y染色體上的AZF基因日益引起醫(yī)學(xué)界的重視與關(guān)注[8]。該基因一旦存在缺失情形，勢必會給男性生育帶來嚴(yán)重不利影響，引發(fā)無精或嚴(yán)重少精[9]。盡管當(dāng)前研究已經(jīng)一致證實(shí)Y染色體微缺失為男性不育的重要誘因，但是關(guān)于具體的缺失機(jī)制卻并未形成一致共識，絕大多數(shù)學(xué)者認(rèn)為Y染色體獨(dú)特的單倍體結(jié)構(gòu)是導(dǎo)致AZF缺失的主要原因[10]。理由如下：由于Y染色體為單倍體結(jié)構(gòu)，自身不具有DNA修復(fù)能力，男性精子生成過程中胚細(xì)胞分裂尤為迅速，導(dǎo)致其與卵子結(jié)合時突變的風(fēng)險(xiǎn)更高，一旦某一個區(qū)域缺失就會給整個Y染色體帶來不利影響[11]。故Y染色體微缺失檢測能夠幫助臨床確診無精或嚴(yán)重少精癥患者的根本病因，目前已經(jīng)在歐美發(fā)達(dá)國家中成為常規(guī)的不孕檢測項(xiàng)目[12]。

AZFa、AZFb、AZFc為3個獨(dú)立的檢測區(qū)域，KRAUSZ等[13]研究表明AZFc區(qū)域的缺失率發(fā)生最高，其次是AZFb，AZFa的檢出率最低，據(jù)此該學(xué)者指出男性不育患者Y染色體AZF區(qū)微缺失是導(dǎo)致其不育的主要原因且關(guān)系十分緊密。本次研究通過對293例無精及嚴(yán)重少精癥患者Y染色體AZF進(jìn)行檢測，結(jié)果發(fā)現(xiàn)Y染色體微缺失21例(7.17%)，AZFc缺失12例(57.14%)、AZFa缺失2例(9.52%)、AZF(b+c)缺失4例(19.05%)、AZF(a+b+c)缺失3例(14.29%)，AZFc區(qū)缺失率最高，次之AZFb，AZFa最低，與現(xiàn)有研究成果基本吻合，均一致證實(shí)AZFc區(qū)域?yàn)閅染色體微缺失的主要類型以及熱點(diǎn)缺失區(qū)域，但本文研究發(fā)現(xiàn)b位點(diǎn)單獨(dú)缺失模式少見，常見聯(lián)合a位點(diǎn)或者c位點(diǎn)出現(xiàn)聯(lián)合缺失，其發(fā)生機(jī)制有待進(jìn)一步研究。此外，本文研究證實(shí)，Y染色體微缺失組FSH顯著高于Y染色體無微缺失組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，而LH、T差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，表明Y染色體微缺失將會導(dǎo)致患者生精能力下降，即便是生出的精子也并未發(fā)育成熟，使得下丘腦-垂體-性腺軸無法正常運(yùn)轉(zhuǎn)，能夠抑制FSH的抑制素分泌嚴(yán)重不足，造成了FSH濃度的升高[14]。Y染色體微缺失組內(nèi)不同分型的無精及嚴(yán)重少精癥患者性激素水平相比較，AZF(a+b+c)缺失模式者FSH、LH水平顯著高于其他缺失模式，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，T差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，提示不同AZF缺失分型與性激素中FSH、LH存在著密切的關(guān)聯(lián)性。AZFa區(qū)域的缺失者通常表現(xiàn)為支持細(xì)胞綜合征(SCOS)，為絕對的無精子癥，供精成為其唯一選擇，AZFb區(qū)域缺失者表現(xiàn)為生精阻滯，精子生成被阻滯在精母細(xì)胞階段，睪丸內(nèi)幾乎沒有成熟精子形成，而AZFc區(qū)域缺失者尚存精子生成能力，但隨著FSH的升高，精子數(shù)目呈進(jìn)行性下降趨勢，所以必須予以及早干預(yù)治療或無創(chuàng)取精后冷凍保存[15]。

4 結(jié) 論

無精及嚴(yán)重少精癥患者Y染色體微缺失位點(diǎn)以AZFc區(qū)域缺失為主、AZFb缺失次之、AZFa缺失少見；所形成的5種缺失模式中，又以AZFb單獨(dú)缺失模式最為少見，常聯(lián)合a位點(diǎn)或者c位點(diǎn)出現(xiàn)共同缺失。FSH水平在Y染色體微缺失患者中顯著升高，其中AZF(a+b+c)缺失模式的FSH水平升高最為顯著，通過檢測Y染色體有無缺失可為輔助生殖及治療提供強(qiáng)有力的幫助。