1-3-β-D葡聚糖和半乳甘露聚糖檢測與血培養(yǎng)真菌結(jié)果的相關(guān)性分析

黃 琳，戴 瑋，張傳明，夏吉榮

(重慶醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院檢驗(yàn)科,重慶 400016)

1,3-β-D-葡聚糖檢測(G試驗(yàn))和半乳甘露聚糖檢測(GM試驗(yàn))作為侵襲性真菌病(IFD)的快速實(shí)驗(yàn)室指標(biāo)已在臨床上廣泛應(yīng)用，從報(bào)道[1-7]顯示，G試驗(yàn)和GM試驗(yàn)對IFD診斷的靈敏度分別在48.3%～92.0%和41.7%～95.0%，特異度分別在35.0%～88.9%和88.4%～97.0%之間，各家報(bào)道的差異較大，這是否與研究者選擇的研究對象數(shù)量，或研究病例診斷方法有關(guān)有待進(jìn)一步驗(yàn)證。文獻(xiàn)[1-7]研究病例在30～500例之間，差異較大；同時(shí)診斷IFD多以臨床診斷方式，而非無菌體液病原學(xué)真菌培養(yǎng)結(jié)果為“金標(biāo)準(zhǔn)”，或病理結(jié)果來確診。因而G試驗(yàn)和GM試驗(yàn)診斷IFD相關(guān)性研究的難點(diǎn)在于臨床確診“金標(biāo)準(zhǔn)”的獲得困難，為進(jìn)一步探討G試驗(yàn)和GM試驗(yàn)在IFD診斷中的臨床價(jià)值，本文對本院2017年3月至2018年6月期間臨床疑為IFD，同時(shí)送檢G試驗(yàn)、GM試驗(yàn)和血培養(yǎng)患者的檢測結(jié)果作相關(guān)性分析，發(fā)現(xiàn)G試驗(yàn)和GM試驗(yàn)與血培養(yǎng)真菌結(jié)果符合率分別為92.1%，86.2%；G試驗(yàn)和GM試驗(yàn)聯(lián)合檢測陰性結(jié)果與血培養(yǎng)真菌結(jié)果符合率高達(dá)99.0%，是排除侵襲性真菌感染的特異性指標(biāo)，現(xiàn)將結(jié)果報(bào)道如下。

1 資料與方法

1.1一般資料 2017年3月至2018年6月間本院臨床疑為IFD患者，其中同時(shí)送檢G試驗(yàn)、GM試驗(yàn)和血培養(yǎng)的住院患者455例，男301例，女154例，平均年齡56.8歲；病例來自重癥監(jiān)護(hù)室、神經(jīng)內(nèi)科、神經(jīng)外科、呼吸內(nèi)科、血液科、干細(xì)胞移植中心、老年科、腎內(nèi)科、感染科、腫瘤科等。根據(jù)中國侵襲性真菌感染工作組2017年“血液病/惡性腫瘤患者侵襲性真菌病的診斷標(biāo)準(zhǔn)與治療原則(第五次修訂版)”標(biāo)準(zhǔn)[8]：以患者病史、危險(xiǎn)因素、可能感染的臨床特征、影像學(xué)檢查等作為疑似IFD患者同時(shí)送檢G試驗(yàn)、GM試驗(yàn)和血培養(yǎng)。其中:(1)血培養(yǎng)真菌結(jié)果陽性，臨床確診為侵襲性真菌感染的49例(IFD組)，男30例，女19例，年齡15～88歲。(2)血培養(yǎng)真菌結(jié)果陰性，臨床確診為非侵襲性真菌感染的406例(非IFD組)，男271例，女135例，平均年齡57.4歲。

1.2儀器與試劑 G試驗(yàn)檢測：MB-80微生物動(dòng)態(tài)快速檢測系統(tǒng)，Tol智能恒溫儀GKT-10MSet動(dòng)態(tài)真菌檢測試劑盒和質(zhì)控品，均由北京金山川科技發(fā)展公司提供。 GM試驗(yàn)檢測：Sunrise酶標(biāo)儀(重慶恩鳴醫(yī)療設(shè)備公司)，離心機(jī)，振蕩器。檢測試劑由美國Bio-Rad公司提供。真菌病原學(xué)檢查：法國生物梅里埃3D血培養(yǎng)儀、Vitek2-Compact全自動(dòng)細(xì)菌鑒定及藥敏分析系統(tǒng)、全自動(dòng)快速微生物質(zhì)譜檢測系統(tǒng)(MS)，美國BD公司BACTECTM FX型全自動(dòng)細(xì)菌培養(yǎng)系統(tǒng)。

1.3方法

1.3.1檢測標(biāo)本 用一次性無菌、無熱源真空采集管采集靜脈血3 mL，進(jìn)行3 000 r/min離心10～15 min，分離血清，2 h內(nèi)完成檢測。不能及時(shí)檢測的標(biāo)本放置2～8 ℃冷藏，但不超過24 h。

1.3.2G試驗(yàn)檢測 (1)標(biāo)本前處理：取離心血清0.1 mL，加入裝有0.9 mL樣品處理液中，混勻后70 ℃孵育10 min，取出立刻放入冷卻槽冷卻5 min，為待測血清樣品。(2)用無熱源的吸頭取待測血清樣品0.1 mL，加入至9 mm×65 mm無熱平底試管中，再加入0.1 mL反應(yīng)主劑溶液，混勻后插入MB-80微生物快速動(dòng)態(tài)檢測系統(tǒng)中進(jìn)行反應(yīng)，反應(yīng)結(jié)束后檢測系統(tǒng)自動(dòng)計(jì)算出待測血清中1,3-β-D-葡聚糖含量。

1.3.3GM試驗(yàn)檢測 (1)標(biāo)本預(yù)處理：在1.5 mL聚丙烯管中加入300 μL待測離心血清和對照血清，每個(gè)試管內(nèi)加入100 μL樣本處理液，混勻后用加熱器在120 ℃的溫度下加熱6 min(或在100 ℃水浴下加熱3 min)后取出再次放入離心機(jī)，離心10 min后取上清液。(2)將預(yù)處理后的待測樣本加入GM抗體包被的微孔板孵育90 min后洗滌，加入四甲基聯(lián)苯胺(TMB)底物顯色，加終止液終止反應(yīng)，用酶標(biāo)儀在450 mm波長下測定樣本與對照孔的OD值，通過換算公式將OD值轉(zhuǎn)化為血清學(xué)指數(shù)，血清學(xué)指數(shù)=樣本OD值/臨界值血清OD值。

1.3.4真菌病原學(xué)檢查 真菌血培養(yǎng)按《侵襲性真菌病臨床實(shí)驗(yàn)室診斷操作指南》進(jìn)行。

1.5G試驗(yàn)和GM試驗(yàn)陽性判斷的標(biāo)準(zhǔn) G試驗(yàn)結(jié)果以試劑盒說明書中1，3-β-D-葡聚糖≤60 pg/mL為陰性。 GM試驗(yàn)結(jié)果以試劑盒說明書中血清指數(shù)I>0.5為陽性；I≤0.5為陰性。

2 結(jié) 果

2.1IFD組、非IFD組的G試驗(yàn)和GM試驗(yàn)檢測值水平 以血培養(yǎng)真菌結(jié)果為IFD確診指標(biāo)，將病例分為IFD組和非IFD組，G試驗(yàn)和GM試驗(yàn)的檢測值水平見表1。

表1 IFD組和非IFD組G試驗(yàn)和GM試驗(yàn) 檢測值水平

2.2G試驗(yàn)和GM試驗(yàn)診斷IFD的臨床效能 以G試驗(yàn)和GM試驗(yàn)檢測結(jié)果大于陽性判斷值為IFD實(shí)驗(yàn)室指標(biāo)，以血培養(yǎng)真菌陽性結(jié)果為IFD確診指標(biāo)。G試驗(yàn)、GM試驗(yàn)診斷IFD的靈敏度、特異度、陽性預(yù)測值(PPV)、陰性預(yù)測值(NPV)、約登指數(shù)性能指標(biāo)，見表2。

表2 G試驗(yàn)、GM試驗(yàn)診斷IFD的性能效能(%)

注：*串聯(lián)檢測表示，兩項(xiàng)試驗(yàn)均為陽性；并聯(lián)檢測表示，兩項(xiàng)試驗(yàn)中任何一項(xiàng)試驗(yàn)陽性;a：與G試驗(yàn)比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，P<0.05；b：與GM試驗(yàn)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,P<0.05；c:串聯(lián)與并聯(lián)試驗(yàn)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義

2.3不同濃度水平的G試驗(yàn)和GM試驗(yàn)對IFD診斷效能 將G試驗(yàn)在不同濃度水平下診斷IFD的效能作ROC曲線分析，G試驗(yàn)濃度在43.5 pg/mL時(shí)，靈敏度75.5%，特異度92.4%,診斷效能最高，SROC=0.859(95%置信區(qū)間78.9%～93.0%)。見圖1。

圖1 G試驗(yàn)診斷IFD的ROC曲線

將GM試驗(yàn)不同血清學(xué)指數(shù)用于診斷IFD作ROC曲線分析，GM試驗(yàn)血清學(xué)指數(shù)在0.49時(shí)，靈敏度和特異度分別為40.8%和93.6%,診斷效能最高，SROC=0.581(95%置信區(qū)間47.2%～68.9%)。見圖2。

圖2 GM試驗(yàn)診斷IFD的ROC曲線

圖3 侵襲性真菌感染的菌株分布

2.4侵襲性真菌感染的菌株類別分布 血培養(yǎng)真菌陽性的49例IFD確診病例中，經(jīng)鑒定為熱帶念珠菌、白色念珠菌、近平滑念珠菌、光滑念珠菌、擬平滑念珠菌、隱球菌等，各類菌株分布見圖3。

3 討 論

本文表1顯示，IFD組和非IFD組的G試驗(yàn)和GM試驗(yàn)檢測結(jié)果差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.001)，G試驗(yàn)和GM試驗(yàn)結(jié)果的合理應(yīng)用將為臨床IFD的早期診治提供重要依據(jù)。從本研究結(jié)果表2中顯示，G試驗(yàn)和GM試驗(yàn)診斷IFD特異度均大于90.0%，串聯(lián)檢測(兩項(xiàng)中任一項(xiàng)陰性)特異度可達(dá)99.0%，比單獨(dú)使用G試驗(yàn)和GM試驗(yàn)診斷IFD有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，說明G試驗(yàn)和GM試驗(yàn)陰性結(jié)果時(shí)可擬排除真菌感染，聯(lián)合檢測診斷效率更高。G試驗(yàn)單獨(dú)用于IFD診斷的靈敏度為65.3%，與文獻(xiàn)報(bào)道[9-13]的靈敏度偏低,這是否與其他研究未全部使用無菌體液真菌病原學(xué)來確診IFD有關(guān)，這還需進(jìn)一步探討。如G試驗(yàn)和GM試驗(yàn)并聯(lián)使用(兩項(xiàng)中任一項(xiàng)陽性)可提高IFD診斷靈敏度至71.4%，而GM試驗(yàn)單獨(dú)用于IFD診斷的靈敏度較低只有24.5%，這可能與GM試驗(yàn)主要用于侵襲性隱球菌、曲霉菌和青霉菌等感染有關(guān)[14 ]，本文血培養(yǎng)確診為隱球菌的只有2例，表明GM試驗(yàn)單獨(dú)作為血流侵襲性真菌感染的實(shí)驗(yàn)室指標(biāo)效率較低。G試驗(yàn)和GM試驗(yàn)臨床診斷界值的合理設(shè)置有助于提高診斷效能，經(jīng)ROC曲線分析，G試驗(yàn)檢測濃度在43.5 pg/mL時(shí)，診斷效能最高，靈敏度75.5%，特異度92.4%,SROC=0.859(95%置信區(qū)間78.9%～93.0%)；GM試驗(yàn)血清學(xué)指數(shù)為0.49時(shí)，診斷效能最高，靈敏度和特異度分別為40.8%和93.6%,SROC=0.581(95.0%置信區(qū)間47.2%～68.9%)。

從本文確診的49例IFD血培養(yǎng)真菌陽性菌株分析(圖3)，侵襲性真菌感染的菌株主要為熱帶念珠菌17例(34.7%)，白色念珠菌13例(26.5%)，近平滑念珠菌10例(20.4%)，光滑念珠菌5例(10.2%)，擬平滑念珠菌、隱球菌及其他共4例(2.0%、6.1%)，相關(guān)信息可為臨床治療提供參考。

G試驗(yàn)和GM試驗(yàn)臨床應(yīng)用時(shí)應(yīng)注意假陽性和假陰性干擾，本文最后確認(rèn)的41例G試驗(yàn)或GM試驗(yàn)假陽性中，有6例經(jīng)血液透析；34例使用了頭孢、碳青霉烯類藥物或輸注了血液制品，1例為銅綠假單胞菌血流感染。確認(rèn)的24例G試驗(yàn)或GM試驗(yàn)假陰性中，有1例為隱球菌感染，17例使用了抗真菌藥物，3例為近平滑念珠菌感染，剩余3例原因不明。此外IFD患者容易合并其他細(xì)菌感染，本研究中有14例合并血流細(xì)菌感染。國外文獻(xiàn)[15]認(rèn)為血流細(xì)菌感染組與無血流細(xì)菌感染組的G試驗(yàn)結(jié)果差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，而國內(nèi)研究認(rèn)為差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義[16]。本文合并感染的病例中只有1例假陰性，因此，真菌合并細(xì)菌感染時(shí)，G試驗(yàn)與GM試驗(yàn)對侵襲性真菌病診斷效能是否有影響也值得進(jìn)一步研究。

用血培養(yǎng)真菌結(jié)果作為IFD診斷的“金標(biāo)準(zhǔn)”研究G試驗(yàn)和GM試驗(yàn)的臨床應(yīng)用價(jià)值，降低了以臨床診斷的不確定性帶來的偏差，為G試驗(yàn)和GM試驗(yàn)的臨床應(yīng)用研究積累了更客觀數(shù)據(jù)。但研究時(shí)應(yīng)注意不確定血培養(yǎng)結(jié)果的負(fù)面干擾，本研究明確為干擾血培養(yǎng)真菌假陽性病例就有17例。排除干擾外還應(yīng)注意局部深部組織器官真菌感染時(shí)，血培養(yǎng)可出現(xiàn)非陽性結(jié)果。正如在本研究收集資料時(shí)發(fā)現(xiàn)有7例通過病理組織檢查確診侵襲性肺真菌病，但多次血培養(yǎng)均為陰性，其中G試驗(yàn)和GM試驗(yàn)診斷IFD靈敏度分別為42.9%和57.1%，并聯(lián)檢測靈敏度為71.4%?？梢钥闯鯣試驗(yàn)靈敏度較上述研究中[1-7]較低，可能與這7例中有3例為肺部隱球菌感染以及病檢病例數(shù)量不足有關(guān)。因此G試驗(yàn)和GM試驗(yàn)對于局限深部真菌感染的診斷仍然有不確定性，僅僅依靠臨床診斷不足以確定其真實(shí)診斷效能，還需要更多的病檢結(jié)果或其他金標(biāo)準(zhǔn)來支撐,但因?yàn)楸狙芯烤劢褂谘囵B(yǎng)作為金標(biāo)準(zhǔn)故未將此類病例納入。此外，本研究只將無菌體液聚焦到了血液，而胸腹水、腦脊液等其他無菌體液標(biāo)本未納入研究，以及血液真菌培養(yǎng)陽性率不理想等影響了確診數(shù)據(jù)收集的量和完整性，今后研究應(yīng)增加其他無菌體液標(biāo)本真菌培養(yǎng)結(jié)果，以及病理診斷結(jié)果，為G試驗(yàn)和GM試驗(yàn)診斷IFD積累更多客觀證據(jù)。

4 結(jié) 論

以血培養(yǎng)真菌結(jié)果作為IFD診斷的“金標(biāo)準(zhǔn)”來研究G試驗(yàn)與GM試驗(yàn)的臨床應(yīng)用價(jià)值，減少了因臨床診斷IFD帶來的不確定性。研究表明：G試驗(yàn)與GM試驗(yàn)是IFD早期診斷的重要實(shí)驗(yàn)室指標(biāo)，聯(lián)合檢測可提高診斷IFD靈敏度和特異度；特別是陰性結(jié)果對排除侵襲性真菌病的意義更為重大，同時(shí)設(shè)置合適的臨界值可以較好地提高診斷準(zhǔn)確性。綜上所述，對其合理應(yīng)用、綜合分析可有效提高IFD的診治水平，推進(jìn)早期診斷、早期治療，減少誤診及漏診。