保存溫度及時(shí)間對(duì)化學(xué)發(fā)光法測(cè)定直接腎素濃度的影響

鄧玲艷，王 旭，李輝軍

(華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院附屬同濟(jì)醫(yī)院檢驗(yàn)科，湖北武漢 430030)

原發(fā)性醛固酮增多癥(PA)，簡(jiǎn)稱原醛癥，是指腎上腺皮質(zhì)病變分泌過(guò)多的醛固酮，導(dǎo)致體內(nèi)潴鈉排鉀，血容量增多，以及腎素-血管緊張素系統(tǒng)受抑制，以血漿高醛固酮和低腎素水平為主要特征，臨床癥狀表現(xiàn)為高血壓伴有(或不伴有)低血鉀的綜合征[1]，是繼發(fā)性高血壓的主要病因之一，約占難治性高血壓的10%左右[2]。研究表明，高血壓人群中采用血漿醛固酮與血漿腎素比值(ARR)篩查后，原醛癥檢出率提高了10倍左右[3]。美國(guó)《原發(fā)性醛固酮增多癥患者診斷治療指南》[1]和中國(guó)《原發(fā)性醛固酮增多癥診治專家共識(shí)》[4]均推薦ARR作為原醛癥的首選篩查指標(biāo)。

由于原醛癥患者腎素水平低，且腎素是ARR的分母，故腎素測(cè)定的準(zhǔn)確性在很大程度上決定了ARR結(jié)果的準(zhǔn)確性。腎素測(cè)定的傳統(tǒng)方法是放射免疫法，其原理是根據(jù)腎素可將血管緊張素原轉(zhuǎn)化成血管緊張素I，通過(guò)測(cè)定血管緊張素I的生成速率來(lái)間接反映血漿腎素活性(PRA)。近年來(lái)，全自動(dòng)化學(xué)發(fā)光法測(cè)定血漿直接腎素濃度(DRC)，由于其操作相對(duì)放射免疫法測(cè)定PRA受影響因素更少、操作更簡(jiǎn)易、更易于標(biāo)準(zhǔn)化且無(wú)放射性污染，逐漸應(yīng)用于臨床[5-6]。

樣本穩(wěn)定性是影響檢測(cè)結(jié)果準(zhǔn)確性的一個(gè)重要因素。研究表明溫度不僅影響PRA[7]，也會(huì)影響DRC[8-11]。因?yàn)椴煌瑢?shí)驗(yàn)室DRC穩(wěn)定性結(jié)果并不完全相同[8-11]，所以本研究的目的是調(diào)查本實(shí)驗(yàn)室血漿中DRC在不同存儲(chǔ)溫度下的穩(wěn)定性，為日常工作提供參考。

1 資料與方法

1.1一般資料 隨機(jī)選擇健康體檢者65例，男35例，女30例，年齡22～56歲，肝腎功能正常，影像學(xué)檢查顯示心臟、肺、肝、脾、腎及腎上腺、子宮及附件、前列腺等重要臟器未見(jiàn)明顯異常，未服用任何影響腎素-醛固酮系統(tǒng)的藥物[1]。

1.2儀器與試劑 血漿直接腎素濃度在意大利索靈化學(xué)發(fā)光免疫分析系統(tǒng) (儀器型號(hào)：LIAISON XL) 上進(jìn)行檢測(cè)，嚴(yán)格按試劑說(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作。

1.3方法 采用伯樂(lè)內(nèi)分泌質(zhì)控品進(jìn)行嚴(yán)格的質(zhì)量控制，批號(hào)40311，累積均值73.9 μIU/mL,CV為3.65%；批號(hào)40313，累積均值107.3 μIU/mL，CV4.19%，均值累積時(shí)間超過(guò)3個(gè)月。自制混合血漿，按CLSI文件EP5-A2 驗(yàn)證精密度，濃度14.4 μIU/mL 批內(nèi)不精密度CV1.0%,總不精密度 3.3%；濃度42.2 μIU/mL 批內(nèi)不精密度CV2.2%,總不精密度 3.0%。

采用乙二胺四乙酸二鉀(EDTA-K2)抗凝真空采血管(BD,美國(guó))于上午7:30-8:30采集空腹靜脈血6 mL(立位)，上下顛倒混勻，室溫離心(3 000×g，10 min)分離血漿并分裝(30 min內(nèi)完成)，排除嚴(yán)重脂血、溶血、黃疸以及血樣體積不足的樣本。新鮮樣本立即上機(jī)檢測(cè)作為即刻值(基線水平)，其他樣本按以下方案儲(chǔ)存。

室溫穩(wěn)定性：20支樣本，每支分成5等份，分別在室溫(25 ℃)放置0、2、4、6、8 h后檢測(cè)；冷藏穩(wěn)定性：20支樣本，每支分成5等份，分別冷藏(4 ℃)0、2、4、6、8 h后檢測(cè)；冷凍穩(wěn)定性：20支樣本(由于操作失誤，最終只有17支樣本檢測(cè)值納入計(jì)算)每支分成4等份，除新鮮樣本外，分別保存在-20 ℃條件下4、8、12周后在37 ℃水浴中快速解凍，并立即檢測(cè)；凍融穩(wěn)定性：5支樣本，每支分成4等份，新鮮樣本立即檢測(cè)作為基線值，其他3組樣本立即凍存于-20 ℃。 第2天,第4組樣本在37 ℃水浴中快速解凍，隨后再凍存于-20 ℃(解凍-凍存在5 min內(nèi)完成)；第3天同一時(shí)間，第3組、第4組樣本重復(fù)相同操作；第4天同一時(shí)間，3組樣本在37 ℃水浴中快速解凍，并立即上機(jī)檢測(cè)。這樣，第2組、第3組、第4組樣本分別凍融1次、2次、3次。

2 結(jié) 果

2.1受試者的一般資料比較 本研究一共選擇65例受試者，按照其血壓，分成理想血壓組(收縮壓：90～120 mm Hg、舒張壓：60～80 mm Hg)42例；以及正常血壓高值組(收縮壓：>120 mm Hg～<140 mm Hg、舒張壓：>80 mm Hg～<90 mm Hg)23例。正常血壓高值組與理想血壓組在收縮壓、舒張壓、體質(zhì)量指數(shù)(BMI)、血清鈉離子濃度、血清肌酐、腎小球?yàn)V過(guò)率(eGFR)的差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，而DRC、年齡、血清K+濃度在這兩組的差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(見(jiàn)表1)。

表1 受試者一般資料

2.2計(jì)算DRC差異率可接受標(biāo)準(zhǔn) 查閱文獻(xiàn)，DRC在健康人中CVb為30.1%[14]。CVa來(lái)源于本實(shí)驗(yàn)室質(zhì)控累積不精密度和驗(yàn)證不精密度：3.3%、3.0%、3.65%、4.19%，計(jì)算TCL分別為17.6%、17.2%、18.1%、19.0%。本實(shí)驗(yàn)以17%作為腎素濃度差異率可接受標(biāo)準(zhǔn)。

2.3DRC在室溫條件下的穩(wěn)定性 在室溫條件下，DRC隨放置時(shí)間的延長(zhǎng)有降低趨勢(shì)，詳見(jiàn)表2。盡管從放置在室溫2 h起，DRC檢測(cè)值與即刻值相比，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，但是放置2 h和放置4 h所有樣本DRC的差異率均在17%以內(nèi)。當(dāng)室溫放置6 h，20例樣本中僅有1例DRC測(cè)定值從3.63 μIU/mL降至2.79 μIU/mL，差異率為-23.2%。故樣本采集后，室溫放置6 h內(nèi)檢測(cè)，絕大多數(shù)DRC降低幅度臨床可接受。

表2 室溫條件下血漿直接腎素穩(wěn)定性

注：差異率>17%認(rèn)為差異臨床不可接受；-表示無(wú)數(shù)據(jù)

2.4DRC在冷藏條件下的穩(wěn)定性 冷藏條件下，DRC隨放置時(shí)間延長(zhǎng)有升高趨勢(shì)，見(jiàn)表3。研究發(fā)現(xiàn)，從冷藏2 h開(kāi)始，DRC檢測(cè)值與即刻值相比，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，而直到冷藏4 h開(kāi)始，有2個(gè)樣本的差異率超過(guò)了TCL(分別為2.48 μIU/mL升高至2.94 μIU/mL，差異率18.6%，19.02 μIU/mL升高至25.14 μIU/mL，差異率32.2%)，并且隨冷藏時(shí)間延長(zhǎng)，差異率超過(guò)TCL的比例逐漸增多。

表3 冷藏條件下血漿直接腎素穩(wěn)定性

注：差異率>17%認(rèn)為差異臨床不可接受；-表示無(wú)數(shù)據(jù)

2.5DRC在冷凍條件下的穩(wěn)定性 研究DRC在冷凍條件下的穩(wěn)定性之前，先觀察DRC的凍融穩(wěn)定性。凍融可使DRC降低，并且隨著凍融次數(shù)增加，DRC檢測(cè)值逐漸降低，見(jiàn)表4。當(dāng)分離后的血漿樣本保存在-20 ℃條件下12周時(shí)，DRC的降低幅度臨床可接受，見(jiàn)表5。

表4 血漿直接腎素凍融穩(wěn)定性

表5 冷凍條件下血漿直接腎素穩(wěn)定性

注：差異率>17%認(rèn)為差異臨床不可接受；-表示無(wú)數(shù)據(jù)

3 討 論

腎素由腎小球旁細(xì)胞合成，或由腎素原在一定條件下轉(zhuǎn)化生成[15]。腎素原是腎素的前體，在血漿中以兩種構(gòu)象存在，一種是無(wú)活性形式，其活性位點(diǎn)被它N段的一個(gè)多肽片段封閉，大概占總量的98%；另一種是活性形式，雖然也含有prosegment，但活性位點(diǎn)未被封閉，這種有活性的含量非常少，不到2%，故健康者外周血中，腎素原的活性非常低。但在低溫(-5 ℃～4 ℃)條件下，無(wú)活性腎素原的prosegment可以打開(kāi)，變成有活性的形式，這一過(guò)程被稱為腎素原的冷激活[15]。由于血漿中的腎素原濃度約為腎素的10倍,在腎素分泌受抑制的患者(如原醛癥患者)體內(nèi)，腎素原的濃度可較腎素濃度高100倍[15]，所以少量腎素原激活都會(huì)使腎素濃度檢測(cè)產(chǎn)生較大影響。

基于腎素原上述特性，當(dāng)血液樣本置于低溫環(huán)境時(shí)，腎素原被冷激活轉(zhuǎn)換為活性腎素，從而影響腎素測(cè)定值的準(zhǔn)確性。然而，若樣本放置在室溫時(shí)間過(guò)長(zhǎng)，腎素也可能由于氧化、變性和構(gòu)象變化等原因?qū)е聺舛冉档?。相關(guān)指南和共識(shí)[1,4]建議，用于腎素檢測(cè)的樣本，從采集、轉(zhuǎn)運(yùn)到分離血漿的時(shí)間不宜超過(guò)30 min，這在日常工作中往往難以做到，尤其當(dāng)需要將樣本轉(zhuǎn)運(yùn)至第三方機(jī)構(gòu)檢測(cè)時(shí)。本研究表明，腎素不穩(wěn)定，直接腎素離體后，不管是保存在室溫還是冷藏條件下，短時(shí)間(2 h)內(nèi)的變化差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。進(jìn)一步分析表明，血漿放置在室溫6 h及冷藏2 h時(shí)，DRC變化幅度可接受。由于樣本冷藏運(yùn)輸較常溫運(yùn)輸繁瑣，因此樣本宜保存在室溫并在采集后的6 h內(nèi)送到實(shí)驗(yàn)室。當(dāng)分離出的血漿樣本冷凍(-20 ℃)12周時(shí)，直接腎素的變化幅度可接受，這與李溪月等[11]的建議一致。此外，本實(shí)驗(yàn)首次研究直接腎素的凍融穩(wěn)定性，發(fā)現(xiàn)凍融會(huì)使DRC降低，僅能凍融一次。

查閱文獻(xiàn)，在相同的檢測(cè)系統(tǒng)，GRUSON等[8]發(fā)現(xiàn)DRC放置在室溫有下降趨勢(shì)，6 h差異開(kāi)始有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，他們建議樣本采集后6 h內(nèi)送檢，與本文的建議相同；GLINICKI等[9]研究表明在樣本采集后20～30 min內(nèi)，DRC在室溫條件下變化不顯著；LOCSEI等[10]發(fā)現(xiàn)當(dāng)樣本放置在室溫2 h時(shí)，DRC顯著降低，但在0℃～5℃條件下2 h，DRC變化不顯著。李溪月等[11]發(fā)現(xiàn)室溫放置6 h，冷藏3 h，DRC的差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。本研究結(jié)果顯示，在冷凍或冷藏2 h后，與基線值比，DRC的均值差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。幾個(gè)實(shí)驗(yàn)室對(duì)均值統(tǒng)計(jì)的結(jié)果的不一樣，可能與人種不同，實(shí)驗(yàn)室環(huán)境不同等因素有關(guān)。但是，上述其他國(guó)內(nèi)外的研究在數(shù)據(jù)分析時(shí)，僅對(duì)血漿DRC的均值做了χ2分析或t檢驗(yàn)，都未將檢測(cè)系統(tǒng)的分析變異和個(gè)體內(nèi)生物學(xué)變異考慮在內(nèi)，這可能是導(dǎo)致本次研究結(jié)果和其他研究結(jié)果不完全相同的主要原因。

在臨床上，由于血漿腎素與醛固酮一起，主要用于原醛癥的篩查及原發(fā)性高血壓的病因分析，而正常血壓高值往往認(rèn)為是原發(fā)性高血壓的前期。因此，在本研究中，筆者對(duì)納入的健康人群進(jìn)行了理想血壓和正常血壓高值的分組，發(fā)現(xiàn)DRC在兩組中差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。然而，血漿中DRC被抑制是原醛癥的特征之一，不同貯存條件是否會(huì)影響原醛癥的篩查效率，有待進(jìn)一步的研究。此外，本研究驗(yàn)證另外一個(gè)有趣的現(xiàn)象，即在健康體檢者中，DRC明顯異于說(shuō)明書(shū)推薦的參考區(qū)間(立位：4.4～46.1 mIU/L)，可能與種族不同有關(guān)[16]。

4 結(jié) 論

本實(shí)驗(yàn)研究顯示，外周血中腎素濃度不穩(wěn)定。在室溫條件下，隨保存時(shí)間延長(zhǎng)降低；在冷藏條件下，隨保存時(shí)間延長(zhǎng)升高；本實(shí)驗(yàn)首次研究DRC凍融穩(wěn)定性，DRC隨凍融次數(shù)增加而降低。因此，樣本采集后應(yīng)在6 h內(nèi)送檢并檢測(cè)，若來(lái)不及檢測(cè)，可凍存于-20 ℃至少12周，應(yīng)避免反復(fù)凍融。