雌激素受體β基因AluI、RsaI位點多態(tài)性與妊娠期糖尿病易感性研究

馬麗媛,李 超，王偉偉

(1.青島大學醫(yī)學部，山東青島 266003;2.青島大學附屬醫(yī)院產(chǎn)科，山東青島 266003；3.臨沂市中心醫(yī)院產(chǎn)科，山東臨沂 276400)

妊娠期糖尿病(GDM)是孕婦妊娠期常見代謝異常疾病，我國GDM患病率為3%～8%，高于同期國際水平[1]。GDM多發(fā)生于妊娠中后期，患者不僅妊娠期高血壓、子癇前期、遠期糖尿病患病風險升高，且易出現(xiàn)早產(chǎn)、巨大兒、新生兒呼吸窘迫癥等新生兒疾病[2]，嚴重威脅母嬰健康。GDM發(fā)病機制復雜，涉及炎癥應答、代謝紊亂及免疫異常等機體內(nèi)系統(tǒng)失衡，由于GDM與2型糖尿病具有遺傳相似性，故遺傳易感性也被認為是GDM發(fā)病的關(guān)鍵因素之一，并且得到諸多研究證實[3]。雌激素通過雌激素受體(ER)發(fā)揮多種生物學效應，可在妊娠中晚期對抗孕激素作用，從而降低脂肪、肌肉組織胰島素敏感性，導致GDM發(fā)生[4]。本研究通過對雌激素受體β(ERβ)基因AluI、RsaI酶切位點基因多態(tài)性進行分析，探討ERβ基因與GDM遺傳易感性關(guān)系，以期為GDM早期預防、干預提供理論依據(jù)。

1 資料與方法

1.1一般資料 選擇青島大學附屬醫(yī)院(下稱本院)2017年1-12月首診GDM患者115例作為GDM組，GDM診斷標準：孕婦空腹血糖≥5.1 mmol/L，口服75 g葡萄糖1 h≥10.0 mmol/L、2 h≥8.5 mmol/L，3項檢測結(jié)果滿足其中1項或以上則診斷為GDM[5]。平均(31.2±4.7)歲，平均孕周(38.3±1.2)周，產(chǎn)前體質(zhì)量指數(shù)(BMI)為(24.7±3.1)kg/m2。另配對選取同期本院健康孕婦115例作為健康對照組，平均(31.9±4.2)歲，平均孕周(38.6±1.1)周，BMI(24.3±2.8)kg/m2。排除標準：(1)具有吸煙史、飲酒史；(2)孕前患有高血壓、2型糖尿病，或甲狀腺功能亢進或減退等疾?。?3)輔助生殖技術(shù)受孕；(4)孕前3個月內(nèi)或孕期使用皮質(zhì)類固醇類藥物史。兩組孕婦均為漢族人群，在年齡、孕周等一般資料比較中差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，具有可比性。本研究醫(yī)院倫理委員會支持，所有入組者均知曉本研究目的、過程及意義，簽署知情同意書。

1.2方法

1.2.1標本采集 孕婦空腹12 h于次日清晨取乙二胺四乙酸二鉀(EDTA-K2)抗凝管、肝素抗凝管靜脈血各5 mL，肝素抗凝血3 500 r/min離心5 min后用于空腹血糖(FBG)、空腹胰島素(FIN)測定，EDTA-K2抗凝于-80 ℃冰箱保存待測。

1.2.2生化指標測定 FBG于本院檢驗科采用日立7600全自動生化分析儀測定，F(xiàn)IN采用羅氏Cobas E602全自動電化學發(fā)光分析儀測定，均購買成品試劑盒，嚴格按照試劑盒說明書進行檢測，實驗室濕度、溫度均符合檢測要求。穩(wěn)態(tài)模式評估(HOMA-IR)指數(shù)=空腹血糖×空腹血胰島素/22.5。

1.2.3待測基因位點PCR擴增 采用北京天根生化科技公司提供的全血DNA提取試劑盒進行總DNA提取，嚴格按照試劑盒說明書進行操作，分光光度儀260/280吸光度值在1.6～2.0之間為合格DNA標本。引物由上海生工生物工程技術(shù)服務有限公司設計并合成，參考相關(guān)文獻序列如下[5]：RsaI上游5′-TCT TGC TTT CCC CAG GCT TT-3′，下游5′-ACC TGT CCA GAA CAA GAT CT-3′，AluI上游5′-GAC CTG CTG CTG GAG ATG CT-3′，下游5′-AAT GAG GGA CCA CAG CA-3′。以提取DNA為模板進行PCR擴增，PCR反應體系：DNA 1.0 μL(0.15 μg/μL)、上游及下游引物各5.0 μL、10×PCR反應緩沖液2.5 μL、dNTP 0.5 μL(10 mmoL/L)、Taq-DNA聚合酶0.5 μL(5 U/μL)，余以雙蒸水補足25 μL。循環(huán)參數(shù)設置：94 ℃預變性4 min，95 ℃ 30 s，62 ℃退火40 s、72 ℃延伸40 s，共35個循環(huán)。擴增產(chǎn)物于-4 ℃保存。

1.2.4RFLP分析 取PCR擴增DNA產(chǎn)物10 μL、限制性內(nèi)切酶各緩沖液1 μL在37 ℃水浴箱內(nèi)酶切3 h。終止反應后以2%瓊脂糖凝膠電泳分離30 min，溴化乙錠染色(0.5 μg/mL)，將酶切凝膠置于紫外凝膠成像儀成像判斷基因型。RsaI酶切區(qū)分RR 基因型(片段長度為125、31 bp)、rr基因型(片段長度為156 bp)、Rr基因型(片段長度為156、125、31 bp)，AluI酶切區(qū)分AA基因型(片段長度為240、67 bp)、aa基因型(片段長度為307 bp)、Aa基因型(片段長度為307、240、67 bp)。

1.3統(tǒng)計學處理 所有數(shù)據(jù)均采用SPSS17.0軟件統(tǒng)計包進行分析。計數(shù)資料采用χ2檢驗，計量資料采用t檢驗；采用擬合優(yōu)度皮爾森χ2檢驗對GDM組、對照組AluI、RsaI基因型分布是否符合Hardy-Weinberg遺傳平衡進行檢測；非條件Logistic回歸分析基因多態(tài)性與GDM易感性關(guān)系，以比值比(OR)及95%可信區(qū)間(CI)進行描述風險度，并經(jīng)民族、年齡、家族史、妊娠次數(shù)等變量校正。所有檢測結(jié)果均以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié) 果

2.1基因型分布 GDM組與對照組AluI位點AA基因型、Aa基因型、aa基因型分布符合Hardy-Weinberg遺傳平衡規(guī)律，P>0.05。GDM組與對照組RsaI位點RR基因型、Rr基因型、rr基因型分布符合Hardy-Weinberg遺傳平衡規(guī)律，P>0.05。表明本研究選擇對象基因型具有群體代表性。

2.2AluI、RsaI位點基因型易感性分析 GDM組AluI位點AA型基因、Aa基因型比例顯著高于健康對照組，aa型基因顯著低于健康對照組，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；基因易感性分析顯示，AA、Aa基因型孕婦會增加GDM患病相對風險度(OR：1.973，95%CI：1.306～2.391，P=0.012；OR：1.426，95%CI：1.112～1.685，P=0.023)，合并分析顯示A等位基因GDM患病風險高于a等位基因(OR：1.755，95%CI：1.287～2.061，P=0.019)。見表1。RsaI位點RR、Rr、rr基因型在GDM組、健康對照組表達差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，基因易感性分析顯示該位點基因型與GDM患病無顯著關(guān)系(P>0.05)。見表2。

表1 AluI位點基因型易感性分析[n(%)]

表2 RsaI位點基因型易感性分析[n(%)]

2.3不同基因型GDM患者生化指標比較 將GDM患者患者按照AluI位點不同基因型進行分組生化指標比較，AA+Aa基因型患者產(chǎn)前BMI、0 h血糖及HOMA-IR指數(shù)顯著高于aa基因型患者，0 h胰島素顯著低于aa基因型患者，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。見表3。RsaI位點與GDM無易感性，未做分析。

表3 不同基因型GDM患者生化指標比較

3 討 論

GDM是一種妊娠期女性首次被檢測出糖耐量或糖代謝異常疾病，多發(fā)于妊娠中晚期，雖然多數(shù)GDM患者在產(chǎn)后可恢復正常糖代謝，但是在妊娠過程中其仍然是孕婦、新生嬰兒相關(guān)疾病主要危險因素之一。GDM不僅會增加孕婦妊娠意外概率，還可因為長期高濃度血糖導致抗感染能力下降而發(fā)生生殖系統(tǒng)感染，此外GDM還可導致分娩結(jié)果改變、早產(chǎn)、巨大嬰兒及孕婦遠期糖尿病等，危及產(chǎn)婦及新生兒安全[1-2]。雌激素是女性內(nèi)分泌系統(tǒng)中重要激素之一，在妊娠早期生理濃度的雌激素可通過上調(diào)胰島素受體表達來增加脂肪、肌肉組織胰島素敏感度[6]，但是當孕周增加至中晚期妊娠時體內(nèi)雌激素濃度增加，相對高濃度雌激素會通過影響胰島素受體表達及對抗孕激素作用，導致機體血糖利用能力下降，出現(xiàn)妊娠期糖尿病[7]。介導雌激素生物學效應的主要是ERα和ERβ，有研究顯示控制這兩種受體表達的基因會由于等位基因多態(tài)性而影響其表達及生物學功能，導致多種疾病發(fā)生[5,8]?；蚨鄳B(tài)性是一種較為常見的生理現(xiàn)象，隨著分子生物學技術(shù)的發(fā)展，這一領(lǐng)域也得到更為深入的研究，目前認為其與多種疾病遺傳易感性相關(guān)[9]。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)ERα基因PvuⅡ、XbaⅠ酶切位點多態(tài)性與GDM相關(guān)[10]，但是ERβ基因多態(tài)性與GDM有無遺傳易感性目前還尚未見報道。

ERβ基因位于染色體14q23.2，有兩種常見基因多態(tài)性位點，RsaI位點：在ERβ基因5號外顯子配體結(jié)合區(qū)的1 082號核苷酸由于點突變會出現(xiàn)RsaI內(nèi)切酶特異性識別位點；AluI位點：ERβ基因8號外顯子3，端非編碼區(qū)的1 730號核苷酸發(fā)生點突變出現(xiàn)AluI內(nèi)切酶特異性識別位點[11]。ERβ基因RsaI位點、AluI位點多態(tài)性被證實與多種臨床疾病相關(guān)。SHOUKRY等[12]對200例絕經(jīng)后女性骨質(zhì)疏松患者RsaI位點進行多態(tài)性分析，發(fā)現(xiàn)R基因可能與絕經(jīng)后女性骨質(zhì)疏松癥易感性相關(guān)，而另一等位基因r則是該病的保護因素。基于雌激素及雌激素受體在孕期中的動態(tài)變化，ERβ基因多態(tài)性也是妊娠相關(guān)疾病研究熱點。DOMNGUEZ等[13]在圍生期抑郁發(fā)病危險因素研究中發(fā)現(xiàn)AluI位點A等位基因呈差異性，風險分析顯示A等位基因是圍生期抑郁高危因素。殷艷等[14]的一項流行病學調(diào)查發(fā)現(xiàn)，AluI位點A基因是維吾爾族婦女妊娠期膽內(nèi)膽汁淤積癥風險因素，而RsaI位點R等位基因是其保護因素。

本研究對GDM患者ERβ基因多態(tài)性進行分析，GDM組與對照組基因型分布均符合Hardy-Weinberg遺傳平衡規(guī)律，提示選擇對象具有群體代表性。研究結(jié)果顯示GDM組AluI位點基因型與對照組相比差異有統(tǒng)計學意義，AA、Aa基因型孕婦會增加GDM患病風險，A等位基因可能是GDM易感性基因。RsaI位點各基因型在GDM組、對照組差異無統(tǒng)計學意義，亦與GDM無易感相關(guān)性。GDM主要表現(xiàn)為血糖、胰島素異常及胰島素抵抗現(xiàn)象，且雌激素受體在孕期中與糖代謝密切相關(guān)，本研究選擇與GDM具有易感相關(guān)性的AluI位點基因進行相關(guān)指標分析，結(jié)果顯示，AA+Aa基因型患者血糖、胰島素抵抗高于aa基因型，而胰島素低于aa基因型，與該位點基因型在GDM、健康人群中分布結(jié)果相符。本研究推測a等位基因調(diào)控的相關(guān)蛋白可能在雌激素信號傳遞過程中發(fā)揮關(guān)鍵作用，通過影響信號傳導來調(diào)控終端胰島素敏感性[15]，該基因型可能具有更高效胰島素利用功能。

4 結(jié) 論

通過本次研究發(fā)現(xiàn)，ERβ基因AluI位點多態(tài)性可能與GDM易感性相關(guān)，A等位基因具有高GDM患病風險，且A等位基因患者糖代謝異常更為嚴重。本研究成果豐富了GDM的遺傳因素相關(guān)理論，為GDM預防和后期干預提供新的依據(jù)。但是本研究還存在一定局限性，如樣本例數(shù)較少、非多中心研究等，還需加強后續(xù)研究，以期進一步明晰GDM遺傳易感性機制。