ELISA法與免疫膜條法檢測抗MDA5抗體、抗TIF1γ抗體的比對分析

李柳冰，劉晨曦，張艷芳,2，程琳琳，晏頌欣，李永哲△

(1.中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院北京協(xié)和醫(yī)院檢驗科，北京 100730；2.吉林大學(xué)第一醫(yī)院檢驗科，吉林長春 130021)

皮肌炎(DM)是以對稱性四肢近端肌無力為特征表現(xiàn)的異質(zhì)性疾病，女性患者居多[1]。肌炎特異度自身抗體(MSAs)與疾病臨床分型、臨床特征相關(guān)，可有效輔助皮肌炎的診斷和預(yù)后評估[2-4]。免疫膜條法能有效快速地進(jìn)行多個自身抗體的檢測，在臨床檢測中的應(yīng)用越發(fā)廣泛。然而，有研究指出[5]，采用免疫膜條法檢測自身抗體，會出現(xiàn)以下情況：(1)多個自身抗體出現(xiàn)假陽性；(2)免疫膜條法對自身抗體(如抗Jo-1抗體)的檢測結(jié)果與其他方法(如免疫沉淀法)得到的檢測結(jié)果存在較大不一致情況?；诖耍疚姆謩e用酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA)法和免疫膜條法檢測皮肌炎患者血清中的兩種MSAs：抗黑色素瘤分化相關(guān)基因5(MDA5)抗體和抗轉(zhuǎn)錄中介因子 1γ(TIF1γ)抗體，探討這兩種方法檢測抗MDA5抗體和抗TIF1γ抗體結(jié)果的差異性。

1 資料與方法

1.1一般資料 本研究納入的180例皮肌炎患者，來源于北京協(xié)和醫(yī)院和衛(wèi)生行業(yè)科研專項資助下的多家醫(yī)院。其中男59例，女121例，年齡2～76歲，平均(43.40±18.64)歲。皮肌炎中包括經(jīng)典皮肌炎(CDM)100例，無肌病性皮肌炎(CADM)11例，幼年型皮肌炎(JDM)29例，皮肌炎合并惡性腫瘤(CAM)40例。CDM和JDM患者均符合1975年Bohan/Peter診斷標(biāo)準(zhǔn)[6-7]，且JDM的發(fā)病年齡<18歲。CADM患者符合Sontheimer診斷標(biāo)準(zhǔn)[8]。CAM患者中對于惡性腫瘤的診斷均符合相應(yīng)臨床診斷標(biāo)準(zhǔn)。同時，排除合并其他自身免疫性疾病的皮肌炎患者。本研究已獲得北京協(xié)和醫(yī)院倫理委員會批準(zhǔn)。

1.2儀器和試劑 日本MBL公司抗MDA5抗體(批號：7873)和抗TIF1γ抗體(批號：7853)ELISA檢測試劑盒；TECAN酶聯(lián)免疫檢測儀；德國歐蒙公司抗肌炎抗體譜IgG檢測試劑盒(批號：DL1530-1601-4G)；歐蒙印記法自動操作儀；EUROLineScan歐蒙印跡法判讀軟件。

1.3方法 本研究采用的抗MDA5抗體ELISA試劑盒、抗TIF1γ抗體ELISA試劑盒及抗肌炎抗體譜IgG檢測試劑盒分別是同批號試劑。血清標(biāo)本于-80 ℃低溫保存并避免了反復(fù)凍融。實驗過程中嚴(yán)格按照試劑說明書進(jìn)行操作并對實驗條件、檢測儀器、實驗人員等因素進(jìn)行嚴(yán)格質(zhì)量控制。

1.3.1ELISA法 按照抗MDA5抗體和抗TIF1γ抗體ELISA檢測試劑盒說明書要求，用樣本稀釋液101倍稀釋血清樣本。在相應(yīng)微孔中分別加入100 μL標(biāo)準(zhǔn)品1、標(biāo)準(zhǔn)品2、陽性對照、陰性對照和稀釋過的血清樣本。室溫(20 ℃～30 ℃)溫育30 min，洗板4次，加入100 μL酶結(jié)合物，溫育30 min，洗板4次后加入100 μL底物，溫育15 min后加入100 μL終止液。于TECAN酶聯(lián)免疫檢測儀波長在450 nm處檢測各孔吸光度值。待測樣本的濃度值(U/mL)=(待測樣品吸光度值-標(biāo)準(zhǔn)品1吸光度值)/(標(biāo)準(zhǔn)品2吸光度值-標(biāo)準(zhǔn)品1吸光度值)×100。樣本濃度>32 U/mL為陽性。

1.3.2免疫膜條法 抗肌炎抗體譜IgG檢測試劑盒包含抗MDA5抗體和抗TIF1γ抗體。將檢測膜條放入溫育槽中，并在每槽中加入1.5 mL樣本緩沖液，搖床溫育5 min。吸去緩沖液，在每槽中加入1.5 mL 經(jīng)101倍稀釋血清樣本。搖床溫育30 min后，清洗3次，每次5 min。隨后，在每槽中加入1.5 mL酶結(jié)合物，搖床溫育30 min后清洗3次。再在每槽中加入1.5 mL底物，搖床溫育10 min后，吸去液體，蒸餾水清洗3次。于歐盟印跡法自動操作儀(EUROBlotMaster)檢測結(jié)果。著色強(qiáng)度>15為陽性。

1.4統(tǒng)計學(xué)處理 采用SPSS20.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析。率的比較采用χ2檢驗，以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。同時進(jìn)行Kappa一致性分析，以P<0.01認(rèn)為兩種方法的一致性具有統(tǒng)計學(xué)意義。Kappa值≥0.75，為一致性好；Kappa值在0.40～<0.75，為一致性一般；Kappa值<0.40為一致性差。

2 結(jié) 果

2.1ELISA法和免疫膜條法的檢測結(jié)果 如表1所示，抗MDA5抗體用ELISA法和免疫膜條法檢測的陽性率分別為29.44%和27.78%，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P=0.726)?？筎IF1γ抗體用ELISA法和免疫膜條法檢測的陽性率分別為28.33%和20.56%，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P=0.086)。

表1 兩種方法檢測抗MDA5抗體和抗TIF1γ抗體陽性率的比較

2.2ELISA法和免疫膜條法對抗MDA5抗體檢測結(jié)果的符合情況 如表2所示，180例樣本中，ELISA法檢測出53例抗MDA5抗體陽性皮肌炎患者，其中有39例免疫膜條法檢測結(jié)果與ELISA法相符，陽性符合率為73.58%(39/53)，陰性符合率為91.34%(116/127)。兩種方法對于抗MDA5抗體檢測結(jié)果的總符合率為86.11%(155/180)。Kappa一致性檢驗：Kappa值=0.660(P<0.001)，認(rèn)為兩種方法對抗MDA5抗體的檢測結(jié)果的一致性有統(tǒng)計學(xué)意義，但一致性一般。

2.3ELISA法和免疫膜條法對抗TIF1γ抗體檢測結(jié)果的符合情況 如表3所示，180例樣本中，ELISA法檢測出51例抗TIF1γ抗體陽性皮肌炎患者，其中有32例免疫膜條法檢測結(jié)果與ELISA法相符，陽性符合率為62.75%(32/51)，陰性符合率為96.12%(124/129)。兩種方法對于抗TIF1γ抗體檢測結(jié)果的總符合率為86.67%(156/180)。Kappa一致性檢驗：Kappa值=0.642(P<0.001)，認(rèn)為兩種方法對抗TIF1γ抗體的檢測結(jié)果的一致性有統(tǒng)計學(xué)意義，但一致性一般。

表2 兩種方法對抗MDA5抗體檢測結(jié)果的比較(n)

表3 兩種方法對抗TIF1γ抗體檢測結(jié)果的比較(n)

3 討 論

抗MDA5抗體和抗TIF1γ抗體均為皮肌炎特異度抗體，對皮肌炎的診斷具有重要意義?？筂DA5抗體最先于日本皮肌炎患者的血清中發(fā)現(xiàn)，該抗體陽性患者具有典型的皮膚受累如手掌丘疹、皮膚潰瘍，且發(fā)生快速進(jìn)展型肺間質(zhì)病變的風(fēng)險增加[9]。靶抗原MDA5是一種維甲酸誘導(dǎo)基因I樣受體，參與抗病毒先天免疫防御，可識別出柯薩奇病毒、鼻病毒、登革熱病毒和牛痘病毒等病毒類型[9]。LI等[10]對628例皮肌炎患者組與221例健康對照組進(jìn)行meta分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)抗MDA5抗體與皮肌炎相關(guān)，尤其是與CADM密切相關(guān)。抗MDA5抗體對CADM診斷的合并靈敏度是62%(95%CI：52%～70%)，合并特異度是100%(95%CI：97%～100%)，綜合受試者工作特征曲線下面積是0.94?？筎IF1γ抗體最早于2006年報道，在成年皮肌炎患者中的陽性率是20%～30%，在JDM患者中的陽性率為30%～40%[11-12]。靶抗原TIF1γ發(fā)揮轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)、腫瘤抑制、DNA損傷修復(fù)等功能[13]?？筎IF1γ抗體與皮肌炎合并惡性腫瘤密切相關(guān)，抗TIF1γ抗體陽性患者中，超過50%患者會出現(xiàn)惡性腫瘤[3,14]。可見抗MDA5抗體和抗TIF1γ抗體是皮肌炎診斷和鑒別診斷不可忽視的輔助手段。

目前，檢測皮肌炎自身抗體多采用ELISA法和免疫膜條法。免疫膜條法由于具有簡便快速等優(yōu)勢，越來越多地應(yīng)用于臨床檢測中。然而，文獻(xiàn)報道指出，免疫膜條法存在一些弊端。HAMAGUCHI等比對免疫沉淀法和免疫膜條法對抗OJ抗體檢測結(jié)果的差異性[15]。9例用免疫沉淀法證實有抗OJ抗體存在的血清，用免疫膜條法的檢測結(jié)果均為陰性；52例用免疫沉淀法證實不存在抗OJ抗體的血清，用免疫膜條法的檢測結(jié)果均為陰性。免疫膜條法對抗OJ抗體的靈敏度為0%，特異度為100%。CAVAZZANA等比對免疫沉淀法和免疫膜條法對抗Mi-2α、Mi-2β、TIF1γ、MDA5、NXP2、SAE、Ku、PM-Scl75、PM-Scl100、SRP、PL-7、PL-12、EJ、OJ、Jo-1抗體檢測結(jié)果的一致性[5]。研究顯示，兩種方法對抗TIF1γ抗體、抗MDA5抗體和抗NXP2抗體檢測的一致性好，對抗Mi-2α/β抗體和抗EJ抗體檢測的一致性一般，對抗Jo-1抗體檢測的一致性差。

前期，本研究采用的抗TIF1γ抗體ELISA試劑盒的檢測結(jié)果與金標(biāo)準(zhǔn)免疫沉淀法進(jìn)行了比對[16]，ELISA法的敏感度和特異度均為100%。本文采用ELISA法和免疫膜條法檢測皮肌炎患者血清中的抗MDA5抗體和抗TIF1γ抗體，并對兩種方法的檢測結(jié)果進(jìn)行比對分析，結(jié)果表明，ELISA法和免疫膜條法對抗MDA5抗體和抗TIF1γ抗體檢測的一致性一般。本研究及前期研究結(jié)果顯示，免疫膜條法與ELISA法、免疫沉淀法的檢測符合度并不十分一致。可見，盡管這3組方法都能檢測自身抗體，相對于操作要求不高，省時快捷的免疫膜條法，ELISA法和免疫沉淀法檢測結(jié)果更準(zhǔn)確。因此，當(dāng)遇到免疫膜條法檢測的自身抗體結(jié)果和患者臨床特征不符的情況時，可采用ELISA法或免疫沉淀法對患者血清標(biāo)本進(jìn)行重新檢測，從而確認(rèn)檢測結(jié)果，更好發(fā)揮自身抗體檢測對臨床的價值。

在本研究中，ELISA法和免疫膜條法結(jié)果不完全一致可能是由于免疫膜條法本身的缺陷所致，如膜條法上重組抗原純度不夠或者失效，導(dǎo)致免疫膜條法假陰性結(jié)果的出現(xiàn)；此外，也可能是由于實驗環(huán)境因素(如溫度)的影響。有研究指出[17]，免疫膜條法對溫度敏感，尤其是對于弱陽性和陰性的標(biāo)本，隨著實驗環(huán)境溫度的升高，膜條的顯色加深，從而導(dǎo)致假陽性結(jié)果的出現(xiàn)?；诖?，當(dāng)采用免疫膜條法進(jìn)行實驗時，應(yīng)先評價該方法的準(zhǔn)確性，探討周圍環(huán)境對實驗結(jié)果的影響，從而保證檢測結(jié)果的準(zhǔn)確性。

4 結(jié) 論

本研究結(jié)果表明，ELISA法和免疫膜條法檢測抗MDA5抗體和抗TIF1γ抗體的一致性程度一般。雖然免疫膜條法能有效節(jié)約時間，但仍需不斷進(jìn)行改善，以提高其檢測的準(zhǔn)確性。