甲魚嗜水氣單胞菌的分離鑒定及體外抑菌試驗

康紹珠 黃志琴 劉小蘭 林 敏 李雅婷 曹 剛 陳林文 梁詩毅 陳飛虎 朱芝秀

江西農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科技學(xué)院，南昌 330045

甲魚因蛋白質(zhì)、維生素E含量高，具有抗氧化、降低膽固醇、抑制腫瘤等藥用價值，備受廣大群眾的喜愛，是餐桌上常見的滋補佳肴。甲魚生活能力及抗病力較強，自然情況下很少發(fā)病，但隨著養(yǎng)殖業(yè)的迅速發(fā)展，甲魚發(fā)病屢見不鮮，報道最多的是嗜水氣單胞菌[1-3]。嗜水氣單胞菌（Aeromonas hydrophila）隸屬于弧菌科（Vibrionaceae）氣單胞菌屬（Aeromonas），它是一種典型的“人-畜-魚”共患病病原菌[4]，可引起各種動物包括魚類[5-6]、甲殼動物[7]、禽類、哺乳動物等感染發(fā)病，導(dǎo)致水生動物赤皮病、腹水病、敗血癥、穿孔病等[1-3]。6月中旬，南昌市某養(yǎng)殖場甲魚大量發(fā)病，精神萎靡，行動遲緩，無食欲，背甲部出現(xiàn)明顯癤瘡，重者潰爛成洞，洞內(nèi)充滿白色膿狀物，底板和腿部出現(xiàn)多處不同程度的出血斑，后期脖子喪失收縮能力（圖1～圖2）。對具有典型病灶的甲魚進行細菌分離鑒定、藥敏試驗、體外抑菌試驗，以期為臨床上防控該病提供科學(xué)的理論依據(jù)。

圖1 底板和腿部出血斑

圖2 背甲部出現(xiàn)明顯癤瘡

1 材料與方法

1.1 病料及試驗動物

南昌地區(qū)某養(yǎng)殖場送檢甲魚（200 g左右）；試驗小白鼠:購自南昌大學(xué)醫(yī)學(xué)院動物試驗中心（18～20 g/只）。

1.2 主要培養(yǎng)基及試劑

普通平板、普通肉湯（LB）、血平板、脫脂奶平板:均由實驗室自行制備；21種微量生化管試劑:杭州天和微生物試劑廠；14種藥敏紙片:杭州濱和微生物試劑有限公司；pcr premix Taq:寶日醫(yī)生物技術(shù)（北京）有限公司。

1.3 主要儀器及設(shè)備

COCI光學(xué)顯微鏡:重慶光學(xué)儀器廠；Motic數(shù)碼顯微鏡:麥克迪奧實業(yè)集團有限公司；電熱恒溫培養(yǎng)箱:上海躍進科學(xué)儀器廠；LDZX-40BI立式自動電熱壓力蒸汽滅菌鍋:上海申安醫(yī)療器械廠；PCR儀、電泳儀、水平電泳槽、灌膠膜具及Versa Doc 100、凝膠成像系統(tǒng):Bio-Rad公司；WP750微波爐:廣東格蘭仕公司。

1.4 病原菌的分離與純化

選取發(fā)病癥狀明顯及瀕臨死亡的甲魚，在無菌操作下鉤取甲魚肝臟等處，劃線接種于脫脂奶培養(yǎng)基，置于37℃恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)18～24 h，觀察菌落培養(yǎng)特性。選取優(yōu)勢溶蛋白的典型單個菌落，劃線接種普通平板，將純化的分離菌轉(zhuǎn)管普通斜面，37℃培養(yǎng)18～24 h后，4℃低溫培養(yǎng)箱短時間保存?zhèn)溆谩?/p>

1.5 病原菌的鑒定

1）培養(yǎng)特性及形態(tài)學(xué)觀察。將分離菌劃線接種普通平板和血平板，37℃培養(yǎng)24 h，觀察菌落的培養(yǎng)特性，挑選單個典型菌落進行革蘭氏染色鏡檢，觀察菌體形態(tài)特征。

2）生理生化特性的鑒定。將分離菌分別接種于21種微量生化反應(yīng)管，37℃恒溫箱培養(yǎng)12～48 h，觀察生長變化情況，方法按微量生化反應(yīng)管說明書進行。

3）16S rRNA分子生物學(xué)上的鑒定（表1）。

1.6 藥物敏感試驗

采用KB紙片擴散法，進行嗜水氣單胞菌對常規(guī)14種抗生素藥敏試驗。將分離菌接種于LB液體培養(yǎng)基中，37℃培養(yǎng)18～24 h后，均勻涂抹普通平板，待菌液吸收后用無菌鑷子輕輕按貼藥敏紙片，37℃培養(yǎng)18～24 h后用數(shù)顯游標卡尺測量抑菌圈直徑。根據(jù)杭州生物有限公司提供的評判標準，判斷分離菌的敏感性，依次將藥物敏感性分為敏感（S）、中介（I）、耐藥（R）。

表1 16S rRNA分子生物學(xué)上的鑒定

1.7 乳酸菌對嗜水氣單胞菌的體外抑制試驗

采用牛津杯法檢測乳酸菌對嗜水氣單胞菌的抑制作用。將分離菌均勻涂布于普通平板上，待菌液晾干后，等距離分4個區(qū)域，將4個牛津杯輕放置于培養(yǎng)基上，往牛津杯中緩慢注入乳酸菌，常溫靜置3～5 h，于37℃培養(yǎng)24 h，測量抑菌圈直徑。

1.8 人工感染動物試驗

將25只小白鼠分成5組（試驗組4組，對照組1組，5只/組）。將分離菌接種普通肉湯，37℃培養(yǎng)24 h后分別腹腔注射對應(yīng)的4組試驗組（0.5 mL/只），對照組腹腔注射同體積的0.85%生理鹽水，每天觀察記錄試驗小白鼠的變化情況。

2 結(jié)果與分析

2.1 菌落形態(tài)特征

在脫脂奶平板上，菌落形態(tài)基本一致，呈圓形，中間略隆起，邊緣整齊，表面光滑，略帶黃色，有透明的溶蛋白圈（圖3）。在兔血瓊脂平板上，菌落均呈典型透明β-溶血環(huán)（圖4）。革蘭氏染色后，在油鏡（10×100）下為革蘭氏陰性，形狀大多呈短桿狀，略呈弧狀，兩端鈍圓，單個分散排列，有的常2個或幾個相連（圖5）。

圖3 透明溶蛋白圈

圖4 透明β溶血圈

圖5 G染色鏡檢（10×100）

2.2 生理生化特性檢測

分離菌均能分解甘露醇、果糖等，不分解乳糖、鼠李糖、木糖等，硝酸鹽、枸櫞酸鹽等為陽性，H2S、尿素等為陰性，具體結(jié)果見表2。單胞菌參考序列同源性均在99.6%以上，通過MEGA6軟件對提取的樣本進行進化樹分析可知（圖7）:分離菌與嗜水氣單胞菌在發(fā)育樹中聚為一個分支，為嗜水氣單胞菌。

表2 分離菌的生理生化結(jié)果

圖6 分離菌16S rRNA的PCR擴增電泳圖

圖7 分離菌16S rRNA序列進化樹

2.3 PCR擴增產(chǎn)物及16S rRNA測序結(jié)果

瓊脂凝膠電泳結(jié)果顯示（圖6），4株分離菌擴增出大小約為1 500 bp目的片段，測序獲得的基因序列通過NCBI數(shù)據(jù)庫BLAST檢索進行序列同源性比對，結(jié)果顯示分離菌與GenBank中登錄的氣

2.4 藥敏試驗結(jié)果

由藥敏試驗結(jié)果可知（表3）:分離菌對林可霉素、頭孢氨卞等完全耐藥；對紅霉素、四環(huán)素等耐藥；對頭孢曲松、恩諾沙星等敏感。

表3 分離菌藥敏試驗結(jié)果 mm

2.5 乳酸菌的體外抑制試驗結(jié)果

8株乳酸桿菌（ZCR1-1～ZCR1-4，ZCR2-1～ZCR2-4）對分離菌均有顯著的抑制較果（表4）。

表4 乳酸菌對分離菌的體外抑制結(jié)果 mm

2.6 動物試驗結(jié)果

攻毒小白鼠經(jīng)過24 h以后，呈現(xiàn)較高的死亡率（表5），對照組健康無病。解剖死亡小鼠可見:肝腫大、質(zhì)地變硬，有明顯的壞死點，顏色由紅棕色變?yōu)榛疑?、甚至變?yōu)楹谏竺娣e淤血（圖8～圖9），將其進行細菌分離培養(yǎng)，得到與自然發(fā)病株一致的菌株。

表5 分離菌對小白鼠的致死情況

圖8 肝臟明顯的壞死點

圖9 肝臟顏色變?yōu)楹谏?/p>

3 討 論

3.1 嗜水氣單胞菌的鑒定

本研究根據(jù)甲魚臨床癥狀、分離菌的培養(yǎng)特性、生理生化特性等，鑒定分離菌疑似嗜水氣單胞菌。本試驗分離菌呈G-短桿菌，菌落光滑、邊緣整齊，略帶黃色，與周毅等[8]報道一致；據(jù)馬子行等[9]報道，嗜水氣單胞菌葡萄糖、七葉甘、精氨酸、賴氨酸、VP等試驗陽性，鳥氨酸、纖維二糖等陰性，與本試驗基本相符；分離株JAY-2、JAY-4靛基質(zhì)陰性，與楊寧等[10]結(jié)果一致；分離株乳糖反應(yīng)陰性，與石亞素等[11]試驗結(jié)果相反，這可能與菌株變異有關(guān)。分離菌通過16S rRNA分子生物學(xué)鑒定及BLAST軟件檢索比對，確定為嗜水氣單胞菌。

3.2 嗜水氣單胞菌的耐藥性

分離株對青霉素類、林可霉素完全耐藥，與鄧小紅等[12]的報道一致；對第3代頭孢菌素頭孢曲松、阿米卡星、慶大霉素、恩諾沙星等高度敏感，與李愛華等[13]不同地區(qū)的菌株對頭孢菌素類100%耐藥有所差異；對諾氟沙星、卡那霉素、阿奇霉素等的敏感性表現(xiàn)不一，出現(xiàn)一定的低敏或耐藥，這與王帥兵等[14]報道的阿奇霉素、諾氟沙星存在一定耐藥性一致，但與蘇振霞等[15]報道諾氟沙星敏感不同，這可能與用藥習(xí)慣及菌株差異有關(guān)。此外，有很多學(xué)者研究表明，嗜水氣單胞菌耐藥率逐漸上升，甚至出現(xiàn)多重耐藥性，如王小亮等[16]報道，A.hydrophila對動物專用廣譜抗生素氟苯尼考呈現(xiàn)較高的耐藥率和耐藥濃度；宋鐵英等[17]發(fā)現(xiàn)A.hydrophila對鏈霉素、氟哌酸等多種抗菌素耐藥。因此，在養(yǎng)殖過程中，應(yīng)做好養(yǎng)殖記錄，盡量使用窄譜抗生素，聯(lián)合用藥和輪換用藥相結(jié)合。

3.3 嗜水氣單胞菌的毒力

分離株攻毒鼠于24 h內(nèi)均死亡，具有較強毒力。分離株均能產(chǎn)生蛋白酶和溶血素，形成透明的溶蛋白圈和β溶血圈，這與牛志偉等[18]報道的嗜水氣單胞菌的毒力因子蛋白酶、氣溶素、血溶素等相符合。

3.4 嗜水氣單胞菌的危害和防治

嗜水氣單胞菌為條件致病菌，分致病菌和非致病菌，在養(yǎng)殖環(huán)境惡劣、機體免疫低下、應(yīng)激等條件下常感染動物發(fā)病，是水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)危害最嚴重的病原菌之一，常引起水產(chǎn)動物的暴發(fā)性死亡，在4-11月均可暴發(fā)，一旦暴發(fā)，治療十分困難。因此，有效防控嗜水氣單胞菌病尤為重要。

本試驗通過乳酸菌的體外抑制試驗可知，乳酸菌對嗜水氣單胞菌有較強的抑制作用，這與任鵬飛[19]報道的乳酸菌對嗜水氣單胞菌有較強的抑制作用相一致，并且其研究發(fā)現(xiàn)乳酸菌發(fā)酵液的抑菌作用強于菌體；朱芝秀等[20]報道，益生菌對嗜水氣單胞菌的抑制作用與其濃度有關(guān)，濃度越大，抑菌作用越強。可見，乳酸菌等益生菌是防治嗜水氣單胞菌的良好的導(dǎo)向。此外，訶子、黃連、五倍子等中草藥[21]對嗜水氣單胞菌具有較好抑菌作用。因此，生物制劑和中草藥的使用，不僅能減少耐藥株的產(chǎn)生，還能有效防控嗜水氣單胞菌。