鈾脅迫下伊樂藻的生理響應與富集特性研究

楊昊 羅學剛 丁翰林 王焯

（西南科技大學生命科學與工程學院，綿陽 621010）

鈾礦是重要的戰(zhàn)略資源和能源，隨著國防軍工和核電發(fā)展的需求的不斷增加，大量的鈾礦資源被開采和利用，在鈾礦冶過程中不可避免地產生了大量難以處理的含鈾污染廢水［1］，含鈾廢水如不經處理直接排放到環(huán)境中，鈾會通過食物鏈積累在人體，從而危害人體健康［2］。目前含鈾廢水的處理方法有物理法、化學法和生物吸附法，其中生物吸附法中的植物處理法因其成本低、無二次污染等優(yōu)點成為近年來廣泛研究的熱點［3-4］。

伊樂藻（Elodea nuttallii）是一種優(yōu)質、速生、高產的沉水植物。伊樂藻適應力極強，只要水上無冰即可栽培，氣溫在5℃以上即可生長，在寒冷的冬季能以營養(yǎng)體越冬，當苦草、輪葉黑藻尚未發(fā)芽時，該植物已大量生長。目前，國內外污染土壤修復主要以陸生植物為主，利用伊樂藻處理水體中的重金屬的研究有了一定的報道，韓華楊等［5］研究發(fā)現(xiàn)將伊樂藻與固定化脫氮微生物聯(lián)用，能提高親水河的氮素脫除能力，張飲江等［6］研究發(fā)現(xiàn)伊樂藻對鎘有較好的去除效果。但是很少有利用伊樂藻處理含鈾廢水的相關報道。因此，本研究以沉水植物伊樂藻為研究對象，研究在不同初始鈾濃度脅迫下，伊樂藻的生理生化指標的響應，以及伊樂藻對鈾的富集特征，旨為其應用于含鈾廢水的處理和水體修復提供一定的理論依據(jù)和實踐參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗材料和實驗環(huán)境 實驗材料伊樂藻購置于綿陽信捷公司，將伊樂藻在1/4 倍Hoagland營養(yǎng)液中培育13-14 d，從中篩選出形態(tài)差異不大的植株用于實驗。實驗于2018年1月-2018年5月，在西南科技大學材料環(huán)境降解及安全性評價實驗大棚進行。

1.1.2 主要儀器 FW-100高速萬能粉碎機（北京永光明醫(yī)療儀器有限公司）；BSA223S-CW電子天平（德國Sartorius集團）；611UF超純水系統(tǒng)（德國Sartorius集團）；Multiwave3000微波消解儀（奧地利安東帕公司）；PF6非色散原子熒光光度計（北京普析通用儀器有限責任公司生產）；7700x電感耦合等離子體串聯(lián)質譜儀（美國安捷倫科技有限公司）；U-3900紫外分光光度計（日立公司）；M-PEA熒光儀（英國Hansatech 公司）。

1.1.3 主要試劑乙酸雙氧鈾（UO2（CH3COO）2·2H2O）、Hoagland 營養(yǎng)液［7］、雙氧水（30% H2O2）、濃硝酸（65%-68% HNO3），本實驗采用的試劑均為分析純。

1.2 方法

1.2. 1 實驗設計 用UO2（CH3COO）2·2H2O配制初始濃度分別為10、20、30 mg/L的溶液，每個處理的體積為10 L，每組設置3個平行。將所有溶液的pH調節(jié)至5.5±0.01，稱取40.0±0.2 g的伊樂藻，放入裝有10 L處理液的27 L的整理箱，進行10 d的水培實驗，每3 d改變一次水培整理箱的位置。

1.2.2 抗氧化酶活性測定［7］SOD活性的測定方法為氮藍四唑還原法（NBT）；POD活性的測定方法為愈創(chuàng)木酚法；CAT活性采用的測定方法為紫外分光光度法。

1.2.3 MDA含量測定 按照王志昊等［8］的方法分別測量450、532和600 nm吸光度。

1.2.4 葉綠素含量測定 按照董杰等［7］的方法分別測量665、649和470 nm吸光度。

1.2.5 葉綠素熒光參數(shù)測定 測定儀器使用M-PEA（英國Hansatech公司），測量前用暗適應夾片處理葉片 20 min，隨后測定［9］。用于 JIP-test分析數(shù)據(jù)［10-11］。

1.2.6 伊樂藻生物量的測定 10 d后，將伊樂藻從溶液中取出，用去離子水反復沖洗3次并用濾紙吸干表面水分，并用電子天平（BSA223S-CW）進行準確稱量。

1.2.7 伊樂藻的鈾富集量測定［12］使用中藥粉碎機（北京永光明）將烘干后的植物粉碎，準確稱取樣品0.2 g，加入5.0 mL濃硝酸和2.0 mL 30%雙氧水，在Synthos 3000消解儀（奧地利安東帕公司）中消解，隨后定容至50 mL后經0.45 μm的濾膜過濾，使用Agilent 7700x ICP-MS（美國安捷倫公司）測定其中鈾含量。

1.2.8 葉片光合氣體交換參數(shù)測定 采用LC Pro-S+全自動便攜式光合儀（澳作生態(tài)儀器有限公司）測定伊樂藻光合氣體交換參數(shù)，選取距頂端第4片成熟葉片測定，每個處理測3次，取平均值。

1.2.9 計算方法與數(shù)據(jù)分析［13］生物富集系數(shù)（BCF）=植物干物質中重金屬含量（mg/kg DW）/水體重金屬初始濃度（mg/L）。

單株U總提取量=植物干物質U濃度（mg/kg）×植物干重（kg）。

使用DPS 7.5進行數(shù)據(jù)分析，應用Origin Pro 8.5軟件作圖。

2 結果

2.1 鈾對伊樂藻生物量的影響

由圖1-A可以看出，隨著初始鈾濃度增加，伊樂藻的鮮重先上升后下降，均小于實驗對照組，分別較處理前下降14.6%、6.2%和7.6%。由圖1-B可以看出，隨初始鈾濃度增加，伊樂藻的干重先增大后減小，都高于對照組，分別較對照組上升2.1%、12.1%和10.6%，干重在初始鈾濃度20 mg/L下最大，為1.54 g。

圖1 不同初始鈾濃度對伊樂藻生物量的影響

2.2 伊樂藻對鈾的富集能力

由圖2-B可以看出，隨著初始鈾濃度增加，伊樂藻的生物富集系數(shù)（Bioconcentration Factors，BCF）先增大后減小，但均小于1，BCF在初始鈾濃度10 mg/L下最大，為0.712 5。由圖2-A和圖2-C可以看出，富集量和總提取量均隨初始鈾濃度的增加而逐漸增大，對鈾的富集量和總提取量在初始鈾濃度30 mg/L時達到最大，分別為14 mg/kg、21.266 μg。

圖2 不同初始鈾濃度下伊樂藻的富集特性

2.3 鈾對伊樂藻抗氧化酶活性和丙二醛含量的影響

由圖3可以看出，隨著初始鈾濃度升高超氧化物歧化酶（Superoxide dismutase，SOD）呈現(xiàn)逐漸下降的趨勢，過氧化物酶（Peroxidase，POD）活性、過氧化氫酶（Catalase，CAT）活性、丙二醛（Malondialdehyde，MDA）含量呈現(xiàn)現(xiàn)先上升后下降的趨勢。所有初始鈾濃度下，SOD活性均低于對照組，而POD活性、CAT活性、MDA含量均高于對照組。SOD活性在初始鈾濃度30 mg/L下最小，較對照組下降86.3%。POD和CAT的活性在初始鈾濃度10 mg/L 處理下最大，分別較對照組上升412.8%、833.3%。MDA含量在初始鈾濃度20 mg/L下最大，較對照組上升152.2%。

圖3 伊樂藻在鈾脅迫下的抗氧化酶活性和丙二醛變化

2.4 鈾對伊樂藻光合色素含量的影響

由圖4-A和4-B可以看出，在鈾脅迫下伊樂藻的光合色素含量呈現(xiàn)出不同的變化趨勢。伊樂藻的葉綠素a、葉綠素b均出現(xiàn)下降趨勢，類胡蘿卜素含量出現(xiàn)了先上升后下降的趨勢。在初始鈾濃度30 mg/L 下，葉綠素a、葉綠素b含量較對照組分別下降27.7%和26.7%。類胡蘿卜素含量較對照組分別下降46.3%、17.3%和35.7%。

2.5 鈾對伊樂藻熒光參數(shù)的影響

由圖5-A、圖5-B和圖5-C看出，隨初始鈾濃度 的 增 加，F(xiàn)v/Fm、PIABS、ABS/CS0、RC/CS0、TRo/CS0和ETo/CS0熒光參數(shù)均呈現(xiàn)逐漸降低的趨勢，在初始鈾濃度30 mg/L下最小，分別較對照組下降47.7%、83.8%、68.7%、90.0%、87.7% 和 87.3%。從圖5-D看出，伊樂藻葉片的快速葉綠素熒光曲線J、I和P點處的熒光值大小為初始鈾濃度0 mg/L＞10 mg/L＞20 mg/L＞30 mg/L，且隨著初始鈾濃度的增加曲線形狀趨于平緩。同時在初始鈾濃度30 mg/L下，J、I和P處熒光值分別較對照組下降41.4%、46.5%和49.2%。

圖4 伊樂藻類胡蘿卜素含量和葉綠素含量

圖5 伊樂藻在鈾脅迫下的熒光指數(shù)

2.6 鈾脅迫下伊樂藻光合參數(shù)的響應

由圖6可以看出，隨著初始鈾濃度升高，凈光合速率（Pn）、氣孔導度（Ga）、胞間CO2濃度（Ci）均呈現(xiàn)下降趨勢。在初始鈾濃度30 mg/L下，三者分別較對照組下降82.1%、20.5%和6.4%，且光合速率下降得較為顯著，而胞間二氧化碳濃度變化幅度不大。

3 討論

目前大量研究發(fā)現(xiàn)，水生植物空心蓮子草等對鈾具有富集能力［14］，這為植物修復鈾污染廢水提供了可能。賈文甫等［15］發(fā)現(xiàn)生物量是植物對逆境脅迫響應的常用指標，且單株總提取量能很好的反應出植物的富集能力［16］。在本實驗中，在一定濃度內的鈾促進伊樂藻生長，如初始鈾濃度20 mg/L處理促進了伊樂藻生長，但僅干重顯著高于對照組，此后，隨著初始鈾濃度的升高伊樂藻生長性能下降，這與姚天月等［17］研究的情況相似，說明伊樂藻對鈾有一定的耐受性，低濃度的鈾對伊樂藻生長有一定促進作用。當水體中鈾濃度超過一定閾值，伊樂藻出現(xiàn)了生長抑制的現(xiàn)象。

隨著初始鈾濃度不斷上升的同時，伊樂藻對鈾的富集量也相應增加，當初始鈾濃度為30 mg/L時達到最高為14.0 mg/kg干重（Dry weight，DW），這與韓旭等［13］研究發(fā)現(xiàn)相似，說明伊樂藻能在一定范圍初始鈾濃度下正常生長，同時對鈾有較好的富集特性。伊樂藻的單株總提取量隨著初始鈾濃度升高，也逐漸上升。在初始鈾濃度為30 mg/L時達到最大，為21.266 μg。在初始鈾濃度為10 mg/L時，BCF系數(shù)達到最高?？赡苁氢櫲芤簼舛容^低時，有利于伊樂藻吸收和轉運物質。伊樂藻的單株總提取量在初始鈾濃度為30 mg/L時，為21.266 μg，且BCF＜1，不滿足重金屬超富集植物的其中指標（Cd為 100 mg/kg，Pb 為 1 000 mg/kg 等，BCF＞1）［15］，因此在本實驗條件下伊樂藻不是鈾超富集植物。

圖6 伊樂藻在鈾脅迫下的光合參數(shù)變化

植物在逆境下會通過抗氧化酶的變化來抵抗脅迫［18-20］。本實驗中，隨著初始鈾濃度增加，POD活性、CAT活性呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢。在鈾脅迫下，伊樂藻SOD活性呈現(xiàn)下降趨勢，在30 mg/L的初始鈾濃度下時最低，且顯著低于對照組，與謝曉紅［21］研究相似，說明伊樂藻內部的自由基累積量超過了自身SOD的清除能力。當溶液中初始鈾濃度為10 mg/L時POD活性達到最大，當初始鈾濃度大于10 mg/L時，出現(xiàn)下降趨勢，可能是初始鈾濃度大于10 mg/L時POD的活性受到了抑制，清除過氧化物的能力下降。當初始鈾濃度為10 mg/L時CAT活性達到最大隨之逐漸下降但仍高于對照組，可能是由于CAT活性逐漸下降導致植物體內H2O2的積累，造成細胞膜結構的損害。植物在逆境脅迫時主要產物MDA是反應膜脂過氧化強弱的指標［22］。馬劍敏等［23］研究發(fā)現(xiàn)，植物MDA含量隨著重金屬濃度的增加，會出現(xiàn)先上升后下降的趨勢，本實驗也出現(xiàn)相同的趨勢。在初始鈾濃度為20 mg/L時MDA含量達到最大，此時伊樂藻葉片膜質過氧化程度加劇，植物受害加重。當初始鈾濃度大于20 mg/L時，MDA含量下降，說明此時的伊樂藻已經慢慢失去對鈾脅迫的應激能力，膜結構的破壞程度也逐漸上升?？梢?，伊樂藻抗氧化酶在應對鈾脅迫時產生了抵抗作用，MDA含量在鈾脅迫時也高于對照組含量，對鈾具有較好的耐受性。

植物葉綠素含量通?？梢苑从吵鲋参锏纳L情況［24］。葉綠素在植物受到脅迫時伊樂藻的葉綠素含量，隨著初始鈾濃度升高，呈現(xiàn)下降趨勢。當初始鈾濃度為30 mg/L時，葉綠素a、葉綠素b達到最低。原因可能是隨著鈾濃度的增加導致伊樂藻的葉綠體整體結構受到破壞，最終表現(xiàn)為葉綠素總含量下降。說明伊樂藻的葉綠素對鈾脅迫較為敏感。隨著鈾濃度增加，類胡蘿卜素含量呈現(xiàn)先升高在降低的趨勢，在初始鈾濃度為20 mg/L時，類胡蘿卜素最高僅次于對照組，說明此時伊樂藻類胡蘿卜素含量的增加有利于增加天線色素的熱耗散，此時降低了PSⅡ反應中心的破壞程度。當鈾濃度繼續(xù)增大的同時，類胡蘿卜素含量下降，說明此時PSⅡ反應中心的破壞程度加劇。

PSⅡ系統(tǒng)是植物內部對重金屬離子作用最敏感的部位［25］，本實驗中伊樂藻的最大光化學效率（Fv/Fm）和光合性能指數(shù)（PIABS）均隨著初始鈾濃度上升呈現(xiàn)下降的趨勢，與謝佳佳等［26］研究相似，說明伊樂藻的PSⅡ系統(tǒng)受到不同程度的影響。隨著初始鈾濃度的不斷上升使得伊樂藻的ABS/CS0RC/CS0、TR0/CS0、ET0/CS0均呈現(xiàn)下降趨勢，在30 mg/L初始鈾濃度下，伊樂藻的PSⅡ受到了嚴重的影響。許多研究發(fā)現(xiàn)［27-30］，植物的熒光動力指數(shù)會隨著脅迫程度的上升，出現(xiàn)下降的趨勢。本研究也出現(xiàn)了相似的趨勢，可能是鈾脅迫下導致伊樂藻PSⅡ反應中心活性和原初光能轉換效率降低，PSⅡ潛在活性被抑制，PSⅡ的電子傳遞能力下降，使得伊樂藻的PSⅡ活性下降。典型的快速熒光動力學曲線在熒光上升階段有O、J、I和P相，由圖5-D可以看出，伊樂藻的曲線形狀隨著初始鈾濃度的增加逐漸變得平緩，與Appenroth等［31］研究紫背萍在鎘脅迫下的趨勢相似，說明鈾脅迫下引起伊樂藻的熒光曲線改變，同時反應出在鈾脅迫下?lián)p傷了PSⅡ受體側的電子傳遞［32-34］。表明鈾脅迫對伊樂藻的葉片光合機構影響主要是PSⅡ及光系統(tǒng)反應中心受到損傷，電子傳遞過程受到了抑制。

植物在受到脅迫時其光合速率下降受到氣孔限制和非氣孔限制兩方面影響［35］。隨著初始鈾濃度的增加，伊樂藻的Pn、Ga、Ci均呈現(xiàn)下降趨勢，同時伊樂藻Ci隨Ga下降而下降，說明Pn下降主要受氣孔限制的影響。

4 結論

本實驗對不同初始鈾濃度下伊樂藻的生理響應及富集特性進行研究，從伊樂藻的抗氧化酶活性、丙二醛含量、熒光動力學指標、葉綠素、光合參數(shù)的變化情況來看，伊樂藻對鈾有耐受能力。但是伊樂藻未達到鈾超富集植物的標準，且在封閉室內條件下進行存在一定的限制，不會造成生態(tài)破壞，而伊樂藻在開放的環(huán)境下的生理特性和富集特性還需要進行更深入的探究。