色素上皮衍生因子對(duì)氧化低密度脂蛋白誘導(dǎo)的巨噬細(xì)胞炎性反應(yīng)的影響研究

張燕，姚樹桐，田華，王曙霞，馬守原，李曼，秦樹存，朱平

動(dòng)脈粥樣硬化（atherosclerosis，AS）是心血管疾病的主要病理基礎(chǔ)，是一種以粥樣斑塊形成為特征的慢性血管炎性疾病［1-2］。既往研究表明，巨噬細(xì)胞與AS的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)，抑制巨噬細(xì)胞炎性反應(yīng)可能成為延緩AS進(jìn)展的關(guān)鍵［3］。氧化低密度脂蛋白（oxidized low-density lipoprotein，Ox-LDL）作為貫穿 AS發(fā)生發(fā)展的關(guān)鍵致炎因子，在內(nèi)皮細(xì)胞功能損傷及啟動(dòng)AS中發(fā)揮著重要作用［4］。色素上皮衍生因子（pigment epithelium-derived factor，PEDF）是一種絲氨酸蛋白酶抑制劑超家族的多功能糖蛋白，具有抗炎、抗氧化應(yīng)激、穩(wěn)定斑塊等作用，其與AS發(fā)生密切相關(guān)［5-7］。筆者所在課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，急性冠脈綜合征（acute coronary syndrome，ACS）患者血漿PEDF水平低于健康人群，且PEDF在AS早期具有減輕Ox-LDL誘導(dǎo)的內(nèi)皮細(xì)胞功能損傷等作用［8］。本研究旨在探討PEDF對(duì)Ox-LDL誘導(dǎo)的巨噬細(xì)胞炎性反應(yīng)的影響，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1 主要試劑與儀器 鼠源RAW 264.7巨噬細(xì)胞購自中國(guó)科學(xué)院上海生物化學(xué)與細(xì)胞生物學(xué)研究所細(xì)胞庫，Ox-LDL（北京協(xié)生生物科技有限公司生產(chǎn)），胎牛血清（fetal calf serum，F(xiàn)BS）、DMEM 培 養(yǎng) 基（Gibco 公司生產(chǎn)），PEDF（PeproTech公司生產(chǎn)），CCK-8（上海碧云天生物科技有限公司生產(chǎn)），兔抗β-actin抗體（Sigma公司生產(chǎn)），抗白介素1（IL-1）抗體、抗單核細(xì)胞趨化因子1（MCP-1）抗體（Abcam公司生產(chǎn)），辣根過氧化物酶標(biāo)記山羊抗兔免疫球蛋白G（IgG）（北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司生產(chǎn)），增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光（enhanced chemiluminescence，ECL）試劑盒（Pierce公司生產(chǎn)），PVDF膜（Millpore公司生產(chǎn)），Annexin V-FITC細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒（南京凱基生物科技發(fā)展有限公司生產(chǎn)），IL-1、MCP-1酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ELISA）試劑盒（上海藍(lán)基生物科技有限公司生產(chǎn)），RIPA裂解液、BCA蛋白定量試劑盒、二甲基亞砜（DMSO）、堿性磷酸鹽、青鏈霉素混合液、胰蛋白酶、4×蛋白上樣緩沖液、30%丙烯酰胺、4×SDSPAGE分離膠緩沖液、4×SDS-PAGE濃縮膠緩沖液（北京Solarbio公司生產(chǎn)）。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng) 本實(shí)驗(yàn)于2018年1—8月完成。采用DMEM培養(yǎng)基（含10% FBS、1%青鏈霉素混合液）于37 ℃、5%二氧化碳（CO2）培養(yǎng)箱中培養(yǎng)巨噬細(xì)胞。

1.2.2 細(xì)胞毒性試驗(yàn) 將DMEM培養(yǎng)基更換為含1%FBS的DMEM培養(yǎng)基，將巨噬細(xì)胞分為空白對(duì)照組及A、B、C、D組，A、B、C、D組細(xì)胞分別給予終濃度為 100、200、400、800 ng/ml的 PEDF 處理 24 h。

1.2.3 分組 將DMEM培養(yǎng)基更換為1% FBS的DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)12 h，之后將巨噬細(xì)胞隨機(jī)分為實(shí)驗(yàn)對(duì)照組、炎性反應(yīng)組、低濃度組、中濃度組、高濃度組。炎性反應(yīng)組細(xì)胞加Ox-LDL 80 mg/L處理24 h誘導(dǎo)炎性反應(yīng)；低濃度組、中濃度組、高濃度組分別加終濃度為100、200、400 ng/ml的 PEDF 處理 24 h， 之 后 加 Ox-LDL 80 mg/L 處理 24 h 誘導(dǎo)炎性反應(yīng)。

1.3 CCK-8法 采用CCK-8法檢測(cè)細(xì)胞活力，具體如下：將巨噬細(xì)胞以1×104/孔接種于96孔培養(yǎng)板內(nèi)，按照上述分組方法處理細(xì)胞后，每孔加100 μl無FBS DMEM 培養(yǎng)基與 10 μl CCK-8，37 ℃繼續(xù)培養(yǎng) 2 h。酶標(biāo)儀在波長(zhǎng)450 nm處測(cè)定各孔吸光度（optical density，OD）值，測(cè)定前輕微振蕩。

1.4 Western blot法 采用 Western blot法檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)IL-1和MCP-1蛋白表達(dá)，具體如下：將巨噬細(xì)胞以1×106/孔接種于6孔培養(yǎng)板內(nèi)，按照上述分組方法處理細(xì)胞后，采用RIPA裂解液提取各組細(xì)胞蛋白，經(jīng)BCA蛋白定量、金屬浴變性處理，并進(jìn)行SDS-PAGE（10%分離膠）分離后電轉(zhuǎn)印至PVDF膜，5%脫脂奶粉封閉 2 h，后分別用兔抗 β-actin 抗體（1∶1 000）、抗 IL-1 抗 體（1∶1 500）、 抗 MCP-1 抗 體（1∶1 500）4 ℃孵育過夜，TBST-T洗膜3次，采用辣根過氧化物酶標(biāo)記相應(yīng)二抗孵育2 h，再次TBST-T洗膜3次。免疫條帶用ECL法顯影，暗室曝光，采用Image-Pro Plus軟件分析蛋白條帶積分吸光度（integrated absorbance，IA）值，以目的蛋白IA值/β-actin IA值的比值反映目的蛋白相對(duì)表達(dá)量。

1.5 ELISA 采用ELISA檢測(cè)細(xì)胞外IL-1、MCP-1蛋白表達(dá)，具體如下：收集各組培養(yǎng)基，4 ℃ 1 000 r/min離心5 min（離心半徑30 cm），取上清。取出試劑盒，于室溫（20～25 ℃）放置 15～30 min。取出酶標(biāo)板，按照標(biāo)準(zhǔn)品的次序分別加入50 μl標(biāo)準(zhǔn)品溶液于空白微孔中，空白微孔中加入50 μl樣品，空白對(duì)照孔加入50 μl蒸餾水，在樣品孔中加入10 μl生物素，除空白對(duì)照孔外各孔中加入100 μl酶標(biāo)記溶液，將酶標(biāo)板用封口膠密封，37 ℃孵育1 h。濃縮洗滌液用蒸餾水1∶100稀釋，然后充分清洗酶標(biāo)板5次，吸水紙徹底拍干。除空白對(duì)照孔外各孔加入顯色劑A、B液各50 μl，室溫避光反應(yīng)15 min后各孔加入50 μl終止液終止反應(yīng)，酶標(biāo)儀在波長(zhǎng)450 nm處測(cè)定各孔OD值。

1.6 Annexin V-FITC/PI雙染法流 式 細(xì)胞術(shù) 采用Annexin V-FITC/PI雙染法流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡率，具體如下：收集各組巨噬細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞密度為5×105/ml，4 ℃ 1 000 r/min 離心 10 min（離心半徑 30 cm），冰冷PBS漂洗細(xì)胞2次。棄上清，加入500 μl Binding Buffer重懸細(xì)胞，加入 5 μl Annexin V-FITC 混勻后室溫避光孵育 15 min，上機(jī)前 5 min 加入 5 μl碘化丙碇（propidium iodide，PI）染色，流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡情況。凋亡細(xì)胞可定量分為4個(gè)細(xì)胞亞群，包括正?；罴?xì)胞（左下象限：Annexin-/PI-）、壞死細(xì)胞（左上象限：Annexin-/PI+）、早期凋亡細(xì)胞（右下象限：Annexin+/PI-）和晚期凋亡細(xì)胞（右上象限：Annexin+/PI+），細(xì)胞凋亡率=早期細(xì)胞凋亡率+晚期細(xì)胞凋亡率。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 18.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計(jì)量資料以（± s）表示，多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用SNK法。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 細(xì)胞毒性試驗(yàn)結(jié)果 空白對(duì)照組細(xì)胞活力為（0.569±0.009），A組 為（0.566±0.011），B組 為（0.561±0.008）、C組 為（0.558±0.009），D組 為（0.548±0.006）。各組細(xì)胞活力比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；其中D組細(xì)胞活力低于空白對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；A、B、C組細(xì)胞活力與空白對(duì)照組比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；PEDF 適宜干預(yù)濃度為 100、200、400 ng/ml。

2.2 細(xì)胞活力 實(shí)驗(yàn)對(duì)照組細(xì)胞活力為（0.524±0.031），炎性反應(yīng)組為（0.333±0.022），低濃度組為（0.329±0.016），中濃度組為（0.289±0.021），高濃度組為（0.247±0.018）。各組細(xì)胞活力比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=114.704，P＜0.05）；炎性反應(yīng)組、低濃度組、中濃度組、高濃度組細(xì)胞活力低于實(shí)驗(yàn)對(duì)照組，中濃度組、高濃度組細(xì)胞活力低于炎性反應(yīng)組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。

2.3 細(xì)胞內(nèi)外IL-1和MCP-1蛋白相對(duì)表達(dá)量 各組細(xì)胞內(nèi)外IL-1和MCP-1蛋白相對(duì)表達(dá)量比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；炎性反應(yīng)組、低濃度組、中濃度組、高濃度組細(xì)胞內(nèi)外IL-1蛋白相對(duì)表達(dá)量高于實(shí)驗(yàn)對(duì)照組，低濃度組、中濃度組、高濃度組細(xì)胞內(nèi)外IL-1蛋白相對(duì)表達(dá)量低于炎性反應(yīng)組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；炎性反應(yīng)組、低濃度組、中濃度組、高濃度組細(xì)胞內(nèi)外MCP-1蛋白相對(duì)表達(dá)量高于實(shí)驗(yàn)對(duì)照組，中濃度組、高濃度組細(xì)胞內(nèi)外MCP-1蛋白相對(duì)表達(dá)量低于炎性反應(yīng)組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05，見表1、圖1）。

表1 5組細(xì)胞內(nèi)外IL-1和MCP-1蛋白相對(duì)表達(dá)量比較（±s）Table 1 Comparison of relative expression quantity of intracellular and extracellular IL-1 protein and MCP-1 protein in the five groups

表1 5組細(xì)胞內(nèi)外IL-1和MCP-1蛋白相對(duì)表達(dá)量比較（±s）Table 1 Comparison of relative expression quantity of intracellular and extracellular IL-1 protein and MCP-1 protein in the five groups

注：IL-1=白介素1，MCP-1=單核細(xì)胞趨化因子1；與實(shí)驗(yàn)對(duì)照組比較，aP＜0.05；與炎性反應(yīng)組比較，bP＜0.05

組別 細(xì)胞內(nèi)IL-1蛋白 細(xì)胞內(nèi)MCP-1蛋白 細(xì)胞外IL-1蛋白 細(xì)胞外MCP-1蛋白實(shí)驗(yàn)對(duì)照組 0.085±0.029 0.251±0.094 0.753±0.081 0.874±0.070炎性反應(yīng)組 0.868±0.062a 1.614±0.433a 1.634±0.092a 1.497±0.107a低濃度組 0.604±0.127ab 1.266±0.312a 1.484±0.093ab 1.406±0.059a中濃度組 0.308±0.063ab 0.841±0.070ab 1.280±0.106ab 1.293±0.064ab高濃度組 0.270±0.056ab 0.709±0.060ab 1.001±0.149ab 1.048±0.129ab F值 51.020 13.641 55.521 40.938 P 值 ＜0.05 ＜0.05 ＜0.05 ＜0.05

圖1 5組細(xì)胞內(nèi)IL-1和MCP-1蛋白表達(dá)電泳圖Figure 1 Electrophoretogram for expression of intracellular IL-1 protein and MCP-1 protein in the five groups

2.4 細(xì)胞凋亡率 實(shí)驗(yàn)對(duì)照組細(xì)胞凋亡率為（9.937±1.459）%，炎性反應(yīng)組為（14.060±1.128）%，低 濃 度 組 為（16.977±1.132）%， 中 濃 度 組 為（30.517±3.820）%，高濃度組為（40.200±4.431）%。各組細(xì)胞凋亡率比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=40.928，P＜0.05）；炎性反應(yīng)組、低濃度組、中濃度組、高濃度組細(xì)胞凋亡率高于實(shí)驗(yàn)對(duì)照組，中濃度組、高濃度組細(xì)胞凋亡率高于炎性反應(yīng)組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05，見圖2）。

圖2 5組流式細(xì)胞圖Figure 2 Flow cytometry for the five groups

3 討論

AS是一種全身、彌漫性血管壁慢性炎性反應(yīng)，可導(dǎo)致心、腦、腎等重要臟器功能損傷，其主要病理過程與炎性反應(yīng)密切相關(guān)，故在AS早期抗炎或可成為其治療關(guān)鍵。Ox-LDL可誘導(dǎo)炎性反應(yīng)，上調(diào)血管內(nèi)皮細(xì)胞及巨噬細(xì)胞產(chǎn)生炎性因子，促進(jìn)巨噬細(xì)胞遷移至血管內(nèi)皮下吞噬脂質(zhì)，進(jìn)一步進(jìn)展為泡沫細(xì)胞，其在AS始動(dòng)階段具有關(guān)鍵作用，但具體機(jī)制尚未十分清楚。既往研究表明，局部和系統(tǒng)性炎性反應(yīng)是導(dǎo)致AS斑塊不穩(wěn)定的關(guān)鍵，減輕巨噬細(xì)胞炎性反應(yīng)有利于增加斑塊穩(wěn)定性［9-10］。巨噬細(xì)胞是釋放促炎因子和破壞斑塊穩(wěn)定性因子的主要細(xì)胞群，因此抑制巨噬細(xì)胞炎性反應(yīng)可能抑制AS進(jìn)展。

PEDF是最先在人胎兒視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞培養(yǎng)基中發(fā)現(xiàn)的一種神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)活性物質(zhì)，體內(nèi)多種細(xì)胞均可表達(dá)PEDF蛋白，其具有抑制血管新生及炎性反應(yīng)、抗腫瘤、抗氧化應(yīng)激、抗血栓形成、促進(jìn)細(xì)胞凋亡、免疫調(diào)節(jié)等作用［11-14］。本研究結(jié)果顯示，D組細(xì)胞活力低于對(duì)照組，A、B、C組細(xì)胞活力與空白對(duì)照組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，提示PEDF終濃度為800 ng/ml對(duì)細(xì)胞有明顯毒性作用，PEDF適宜干預(yù)濃度為100、200、400 ng/ml。

巨噬細(xì)胞通過在血管內(nèi)皮遷徙、聚集、釋放炎性因子及炎性趨化因子（如MCP-1、IL-1）等復(fù)雜過程而導(dǎo)致炎性反應(yīng)［15］。既往研究表明，PEDF可通過抑制AS過程中MCP-1、IL-1、腫瘤壞死因子α（tumor necrosis factor-alpha，TNF-α）等各種炎性因子生成，進(jìn)而發(fā)揮抗炎作用［16］。本研究結(jié)果顯示，炎性反應(yīng)組、低濃度組、中濃度組、高濃度組細(xì)胞內(nèi)外IL-1蛋白相對(duì)表達(dá)量高于實(shí)驗(yàn)對(duì)照組，低濃度組、中濃度組、高濃度組細(xì)胞內(nèi)外IL-1蛋白相對(duì)表達(dá)量低于炎性反應(yīng)組；炎性反應(yīng)組、低濃度組、中濃度組、高濃度組細(xì)胞內(nèi)外MCP-1蛋白相對(duì)表達(dá)量高于對(duì)照組，中濃度組、高濃度組細(xì)胞內(nèi)外MCP-1蛋白相對(duì)表達(dá)量低于炎性反應(yīng)組，提示終濃度為200、400 ng/ml的PEDF能有效下調(diào)IL-1和MCP-1蛋白表達(dá)，進(jìn)而發(fā)揮抗炎作用。

WEN等［17］研究表明，降低巨噬細(xì)胞活性或促進(jìn)巨噬細(xì)胞凋亡均可達(dá)到抗炎效果，因此促進(jìn)巨噬細(xì)胞凋亡實(shí)質(zhì)也是抗炎過程。本研究結(jié)果顯示，炎性反應(yīng)組、低濃度組、中濃度組、高濃度組細(xì)胞活力低于實(shí)驗(yàn)對(duì)照組，細(xì)胞凋亡率高于實(shí)驗(yàn)對(duì)照組；中濃度組、高濃度組細(xì)胞活力低于炎性反應(yīng)組，細(xì)胞凋亡率高于炎性反應(yīng)組，提示終濃度為200、400 ng/ml的PEDF能有效降低巨噬細(xì)胞活力、促進(jìn)細(xì)胞凋亡。

綜上所述，終濃度為200、400 ng/ml的PEDF能有效降低巨噬細(xì)胞活力，下調(diào)IL-1和MCP-1蛋白表達(dá)，促進(jìn)巨噬細(xì)胞凋亡，進(jìn)而抑制Ox-LDL誘導(dǎo)的巨噬細(xì)胞炎性反應(yīng)。但PEDF延緩AS發(fā)展的可能機(jī)制仍有待進(jìn)一步研究探索。

作者貢獻(xiàn)：姚樹桐、秦樹存進(jìn)行文章的構(gòu)思與設(shè)計(jì)；張燕、馬守原、李曼進(jìn)行研究的實(shí)施與可行性分析；張燕進(jìn)行數(shù)據(jù)收集、整理、分析，結(jié)果分析與解釋，負(fù)責(zé)撰寫論文；田華、王曙霞進(jìn)行論文的修訂；王曙霞、秦樹存負(fù)責(zé)文章的質(zhì)量控制及審校；朱平對(duì)文章整體負(fù)責(zé)，監(jiān)督管理。

本文無利益沖突。