NaN3誘變和鹽堿脅迫對苜蓿愈傷組織生長和生理特性的影響

李 波，鄔婷婷

(齊齊哈爾大學生命科學與農(nóng)林學院 抗性基因工程與寒地生物多樣性保護黑龍江省重點實驗室，黑龍江 齊齊哈爾 161006)

苜蓿為重要的豆科牧草，營養(yǎng)價值高，除作為飼草外，還具有多重生態(tài)功能，是生態(tài)價值潛力巨大的生態(tài)牧草[1-2]。但苜蓿優(yōu)良種苗較少，其開發(fā)和利用均受到了不同程度的制約。誘變育種技術可以通過人為誘導加快變異的發(fā)生，不僅可以獲得新的突變材料，還有可能產(chǎn)生生物學上有用的變異體。利用人工誘變技術，可豐富苜蓿種質(zhì)資源，現(xiàn)已成為選育苜蓿新品種的重要來源。目前，對植物的抗鹽研究多以氯化鈉為主，如張學云等[3]對新疆大葉苜蓿愈傷組織進行不同60Co-γ射線和不同濃度NaCl篩選得到了高達1%耐鹽性突變株；楊靜慧等[4]發(fā)現(xiàn)耐NaCl的松散型苜蓿愈傷組織具有更高的可溶性糖和游離脯氨酸含量。我國北方有相當大面積鹽堿土，其主要鹽分是堿性鹽，在增加了土壤鹽度的同時還造成土壤pH值的明顯提高，表現(xiàn)出比中性鹽更大的生態(tài)破壞力，但目前針對生理堿性鹽的研究相對較少[5-7]。針對北方地區(qū)的鹽堿土壤，探討苜蓿在鹽堿脅迫下的適應性，篩選抗鹽堿的苜蓿突變體，培育綜合性狀優(yōu)良的苜蓿顯得尤為重要。

疊氮化鈉(NaN3)可透過膜進入細胞內(nèi)，使DNA堿基替換方式發(fā)生改變，引起點突變的產(chǎn)生[8]。NaN3的誘變率比較高，如付鳳玲等[9]用NaN3誘變玉米愈傷組織，獲得22個再生植株株系，對再生植株株系進行耐旱性鑒定，篩選出5個耐旱性高于未誘變對照的誘變株系；韓曉玲[10]將NaN3應用于小冠花子葉的愈傷組織誘變，分別以NaCl和脯氨酸類似物 L-羥基脯氨酸( Hyp) 為篩選劑，獲得了耐鹽性較對照明顯增強的細胞系，后代與對照系相比，生理生化特性方面耐鹽系抗氧化系統(tǒng) SOD 和 POD 酶活性顯著提高。同時NaN3具有無殘毒、便宜、高效、使用安全等優(yōu)點[11]，因此本試驗以NaN3為誘變劑，對愈傷組織進行誘變處理，探討NaN3對苜蓿愈傷組織耐鹽堿的誘變效果，通過對耐鹽堿苜蓿突變體愈傷組織的生長和生理指標的變化分析，了解突變體在生長生理代謝上的變化規(guī)律，為進一步開展苜蓿誘變育種工作提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

以“中苜1號”苜蓿品種的無菌苗的葉片誘導出的愈傷組織為材料，由齊齊哈爾大學植物組織培養(yǎng)研究室提供。

1.2 試驗方法

1.2.1 愈傷組織的繼代培養(yǎng) 將愈傷組織切割成0.5 cm3左右小塊，轉接到繼代培養(yǎng)基中， 20 d繼代1次。愈傷組織的繼代培養(yǎng)基為MS +2，4-D 1.0 mg·L-1+6-BA 0.5 mg·L-1+30 g蔗糖+8.5 g瓊脂(pH=5.8)。培養(yǎng)條件為(25±1)℃恒溫培養(yǎng)箱，光照強度為81～162 μmol·m-2·s-1，光照時間為14 h·d-1。

1.2.2 NaN3誘變和鹽堿脅迫愈傷組織 配置NaN3誘變培養(yǎng)基，用pH=7.0，0.2M磷酸緩沖液配置NaN3溶液，加于愈傷組織繼代培養(yǎng)基內(nèi)，使NaN3溶液濃度分別為1.0、2.0、3.0、4.0 mmol·L-1和5.0 mmol·L-1。將愈傷組織小塊置于含不同濃度NaN3的液體培養(yǎng)基中，在80 rpm·min-1搖床上震蕩1 h后將愈傷組織轉到愈傷組織繼代培養(yǎng)基上培養(yǎng)，分別在4、8 d和12 d統(tǒng)計愈傷組織存活率，確定NaN3誘變愈傷組織的致死濃度(LC100)和半致死濃度(LC50)。將存活的愈傷組織繼代培養(yǎng)，每瓶接種1 g左右愈傷組織，分別在10、15、20 d和25 d測定每瓶愈傷組織的鮮重，即為其生物量。

配置含有一定濃度的中性鹽NaCl、堿性鹽Na2CO3和NaHCO3的愈傷組織鹽堿脅迫的MS培養(yǎng)基，3種鹽堿濃度分別為50、100、150 mmol·L-1和200 mmol·L-1。將0.5 cm3愈傷組織小塊置入鹽堿梯度培養(yǎng)基中，每種濃度5～6瓶，每瓶接種5～6塊愈傷組織，25℃恒溫培養(yǎng)，分別在4、8 d和12 d統(tǒng)計愈傷組織的存活率，確定鹽堿脅迫愈傷組織致死濃度(LC100)和半致死濃度(LC50)。將處理后存活的愈傷組織轉入到未加鹽堿的MS培養(yǎng)基中繼續(xù)培養(yǎng)，每瓶接種2 g左右愈傷組織，采用稱量法分別在10、15、20 d和25 d稱量愈傷組織的鮮重即為其生物量。

將NaN3誘變(LC50)的愈傷組織植入不同鹽堿(LC100)培養(yǎng)基中進行脅迫處理，后轉入愈傷組織繼代培養(yǎng)基，培養(yǎng)過程同前。20 d左右繼代1次，繼代培養(yǎng)3～4次獲得一定數(shù)量的誘變+鹽堿脅迫愈傷組織即可用于生理指標測定。

1.2.3 生理指標測定 采用考馬斯亮藍法測定可溶性蛋白含量[12]，采用硫代巴比妥酸法測定可溶性糖和丙二醛(MDA)含量[13]，采用茚三酮法測定脯氨酸含量[12]，采用電導儀法測定相對電導率[12]，各指標測定重復3次。

1.3 統(tǒng)計學分析

利用統(tǒng)計分析軟件SPSS 17.0對所測定各項指標的數(shù)據(jù)進行方差分析，比較各項指標變化的差異顯著性。

對其抗鹽堿性的綜合評價采用隸屬函數(shù)法，計算抗鹽堿性相關指標的隸屬函數(shù)值。

隸屬函數(shù)值計算公式:R(Xi)=(Xi-Xmin)/(Xmax-Xmin)；反隸屬函數(shù)值計算公式:R(Xi)=1-(Xi-Xmin)/(Xmax-Xmin)(式中，Xi為指標測定值，Xmin、Xmax為所有試驗材料某項指標的最小值和最大值)。將抗性隸屬值進行累加求出平均值:

X=∑U(Xi)/n

式中，X是所求平均抗性的隸屬值，隸屬值越大其抗鹽堿性越強。

2 結果與分析

2.1 NaN3誘變對苜蓿愈傷組織生長的影響

隨著NaN3濃度和培養(yǎng)時間的增加，愈傷組織的存活率下降(見表1)。誘變處理后培養(yǎng)4～12 d，NaN3濃度為1.0～3.0 mmol·L-1時，愈傷組織的存活率均在50%以上，NaN3濃度為4.0～5.0 mmol·L-1時，愈傷組織的存活率均在50%以下，特別是NaN3濃度為5.0 mmol·L-1，表現(xiàn)為生活力急劇降低，顏色由淡黃色轉變?yōu)楹稚Ｓ鷤M織在NaN3濃度為3.0 mmol·L-1，培養(yǎng)8 d和12 d時，其存活率分別為54.55%和50.00%，NaN3濃度為5.0 mmol·L-1，培養(yǎng)8 d時，愈傷組織的存活率為12.00%，3.0 mmol·L-1NaN3(8 d)為NaN3誘變愈傷組織的半致死濃度，5.0 mmol·L-1NaN3(8 d)為其致死濃度。

NaN3誘變抑制了愈傷組織的生長，導致愈傷組織的生物量低于對照組(見表1)，誘變處理后培養(yǎng)10 d的愈傷組織，NaN3濃度為1.0～3.0 mmol·L-1時，愈傷組織生物量與對照相比下降幅度在50%以內(nèi)，其余處理濃度和處理時間愈傷組織生物量與對照相比下降幅度均在50%以上，尤其在NaN3濃度為4.0 mmol·L-1，誘變20 d和25 d時，生物量下降幅度均在80%以上。隨著NaN3濃度的增加和培養(yǎng)時間的延長，愈傷組織生物量增加的幅度不同，在4.0 mmol·L-1NaN3濃度下，愈傷組織幾乎不生長。不同濃度NaN3誘變后的20 d愈傷組織的生物量分別比對照降低了60.85%、67.35%、70.77%和81.88%。在培養(yǎng)相同天數(shù)下，NaN3濃度越高，愈傷組織的生物量積累的越少。

2.2 鹽堿脅迫對苜蓿愈傷組織生長的影響

不同濃度NaCl、NaHCO3和Na2CO3脅迫下苜蓿愈傷組織存活率見表2。隨著NaCl、NaHCO3和Na2CO3濃度的增加和培養(yǎng)時間延長，愈傷組織存活率呈下降趨勢，在脅迫12 d時，200 mmol·L-1各鹽、堿脅迫下愈傷組織的存活率均低于5%，NaCl和NaHCO3濃度為150 mmol·L-1時，其存活率分別為52.14%和51.22%，100 mmol·L-1Na2CO3脅迫存活率為50.33%，200 mmol·L-1NaCl、NaHCO3和Na2CO3(12 d)為其致死濃度，150 mmol·L-1NaCl和NaHCO3、100 mmol·L-1Na2CO3(12 d)為其半致死濃度。鹽堿脅迫愈傷組織的存活率變化為NaCl>NaHCO3>Na2CO3。

表1 NaN3誘變對苜蓿愈傷組織的存活率和生物量的影響

注：同列不同小寫字母表示各處理間的差異達到顯著水平(P<0.05)。下同。

Note: Different lowercase letters within the same column mean significant difference among treatments at 0.05 level.The same below.

不同濃度NaCl、NaHCO3和Na2CO3脅迫下愈傷組織生物量變化見表2，除50 mmol·L-1NaCl外，隨著NaCl、NaHCO3和Na2CO3濃度的增加，愈傷組織的生物量呈下降趨勢。20 d鹽堿脅迫下愈傷組織，100、150 mmol·L-1和200 mmol·L-1NaCl脅迫愈傷組織的生物量比對照分別降低13.90%、36.10%和65.63%，50、100、150 mmol·L-1和200 mmol·L-1NaHCO3脅迫愈傷組織的生物量比對照分別降低21.71%、46.03%、64.39%和67.37%，50、100、150 mmol·L-1和200 mmol·L-1Na2CO3脅迫愈傷組織的生物量比對照分別降低61.54%、65.88%、73.20%和71.34%，誘變處理后培養(yǎng)20 d和25 d的愈傷組織，200 mmol·L-1NaCl、150 mmol·L-1和200 mmol·L-1NaHCO3及Na2CO3脅迫下生物量下降幅度均在60%以上。3種鹽堿脅迫愈傷組織的生物量的變化為NaCl>NaHCO3>Na2CO3，說明堿性鹽對愈傷組織生物量的影響更大。差異顯著性分析顯示，除NaCl 50 mmol·L-1脅迫組外，其它鹽堿濃度脅迫組與對照組愈傷組織生物量比較差異均顯著(P<0.05)。

2.3 鹽堿脅迫對苜蓿愈傷組織滲透相關生理指標的影響

3種鹽堿脅迫對苜蓿愈傷組織的5項生理指標的變化見表3，在3種鹽堿的半致死濃度脅迫(NaCl:150 mmol·L-1，12 d；Na2CO3:100 mmol·L-1，12 d；NaHCO3:150 mmol·L-1，12 d)下，愈傷組織可溶性蛋白、可溶性糖和脯氨酸含量均高于對照組，MDA含量和相對電導率均低于對照組，其中NaCl脅迫處理的可溶性蛋白、可溶性糖和脯氨酸含量最高，MDA含量和相對電導率最低。NaCl、Na2CO3和NaHCO3脅迫后的愈傷組織的可溶性蛋白含量分別比對照組增加了42.65%，28.20%和32.94%，可溶性糖含量分別比對照組增加了154.20%，49.69%和101.81%，脯氨酸含量分別比對照組增加了150.55%，69.01%和93.85%，MDA含量分別比對照組降低了9.97%，2.95%和5.01%，相對電導率分別比對照組降低了16.65%、12.63%和14.98%。鹽堿脅迫通過提高可溶性蛋白、可溶性糖和脯氨酸3種滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)的積累，降低了愈傷組織的MDA和電導率。對于鹽堿脅迫下愈傷組織可溶性蛋白、可溶性糖、脯氨酸、MDA和相對電導率的方差分析顯示，不同脅迫處理間差異均顯著(P<0.05)。

表2 鹽堿脅迫對苜蓿愈傷組織的存活率和生物量的影響

表3 鹽堿脅迫對苜蓿愈傷組織滲透相關生理指標的影響

注： LC50代表相關脅迫的半致死濃度。下同。

Note：LC50is the semi-lethal concentration of related stress. The same below.

2.4 NaN3與鹽堿脅迫對苜蓿愈傷組織滲透相關生理指標的影響

NaN3誘變苜蓿愈傷組織對3種鹽堿脅迫5項滲透相關生理指標的變化見表4，3種鹽堿對NaN3誘變苜蓿愈傷組織生理變化反應不一，NaN3誘變組和疊加3種鹽堿誘變組的可溶性蛋白、可溶性糖、脯氨酸含量均高于對照組，MDA含量和相對電導率均低于對照組，可溶性蛋白含量分別增加了47.07%、53.57%、22.31%和47.69%，可溶性糖含量分別增加了24.79%、162.86%、58.36%和109.54%，脯氨酸含量分別增加了47.78%、162.86%、80.00%和107.25%，MDA含量分別降低了2.35%、11.17%、3.64%和5.54%，相對電導率分別降低了15.13%、17.96%、16.79%和17.28%。

除NaN3(LC50)+ Na2CO3(LC100)組外，其它各誘變組的愈傷組織可溶性蛋白、可溶性糖和脯氨酸含量均高于NaN3誘變組和對照組，MDA含量和相對電導率均低于NaN3誘變組和對照組。在誘變的愈傷組織中，NaCl和NaHCO3脅迫組與NaN3誘變組比較，愈傷組織可溶性蛋白含量分別增加了4.42%和0.42%，Na2CO3脅迫組愈傷組織可溶性蛋白含量降低了16.84%；NaCl、Na2CO3和NaHCO33種單鹽脅迫后的愈傷組織可溶性糖含量分別增加了110.64%、26.90%和67.91%，脯氨酸含量分別增加了77.87%、21.80%和40.24%，MDA含量分別降低了9.03%、1.32%和3.27%，相對電導率分別下降了3.34%、1.95%和2.54%。NaN3誘變和鹽堿脅迫可以促進愈傷組織可溶性蛋白、可溶性糖和脯氨酸3種滲透物質(zhì)的積累，降低細胞膜電導率和細胞MDA含量，誘變后3種鹽堿比較，NaCl脅迫下積累的滲透物質(zhì)最多，誘變與鹽堿脅迫組方差分析顯示，3種滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)差異顯著(P<0.05)，MDA和相對電導率差異顯著(P<0.05)。

2.5 苜蓿愈傷組織鹽堿抗性的綜合評價

游離脯氨酸、可溶性蛋白和可溶性糖含量等滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)和相對電導率、MDA含量均能反映植物滲透調(diào)節(jié)或細胞膜受到的傷害，同時各指標中存在著一定的相關性和差異性，在具體進行植物耐鹽性評價時需要綜合考慮。將苜蓿愈傷組織在各個處理下測定的可溶性蛋白、可溶性糖、脯氨酸、MDA和相對電導率等5項生理指標的數(shù)據(jù)代入隸屬函數(shù)公式中計算出隸屬度，5項生理指標隸屬值見表5。單一鹽堿脅迫下的隸屬值均高于對照組，NaN3+鹽堿脅迫的苜蓿愈傷組織的隸屬值均高于對照和NaN3誘變組，說明苜蓿對鹽堿脅迫有一定的抗性，且NaN3

表4 NaN3誘變和鹽堿脅迫對苜蓿愈傷組織滲透相關生理指標的影響

注：LC100代表相關脅迫的致死濃度。下同。

Note: LC100is the lethal concentration of related stress. The same below.

表5 滲透相關生理指標隸屬函數(shù)值

誘變可以提高苜蓿愈傷組織對鹽堿的抵抗能力。綜合分析可知，隸屬函數(shù)綜合評價值越大，表明抗鹽堿性對苜蓿的滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)積累越多和膜脂透性的影響越小，則植物抗鹽堿性越強。苜蓿愈傷組織在NaN3誘變和單一鹽堿脅迫下，抗鹽堿的強弱順序為：NaCl>NaHCO3>Na2CO3。

3 討論與結論

3.1 NaN3誘變和鹽堿脅迫對苜蓿愈傷組織生長的影響

組織培養(yǎng)技術與化學誘變育種結合，可提高突變頻率和育種效率，不同的外植體對化學誘變劑的敏感性不同[14-15]，濃度高毒害大，誘變材料存活率低，濃度低，誘變效果差。因此，在誘導前應確定合適的處理濃度。本試驗采用NaN3作為誘變劑，依據(jù)愈傷組織在含NaN3誘變培養(yǎng)基的存活率，確定其半致死濃度為3.0 mmol·L-1，在相同NaN3濃度處理下，愈傷組織隨著處理時間的增加存活率和生物量降低，在同一處理時間下，愈傷組織隨著NaN3濃度增加存活率和生物量降低，這與羅雷等[16]利用化學誘變劑誘導番茄耐低溫突變體研究結果一致，說明NaN3對愈傷組織的增殖有一定阻礙作用。

誘變突變發(fā)生的方向是不定向的，可根據(jù)實際育種的需求選育突變類型做定向篩選，以獲得所希望的具有某些性狀改良的突變體。本試驗在耐鹽堿苜蓿突變體的篩選上，通過NaN3誘變作用改變愈傷組織的生理特性，再經(jīng)鹽堿選擇壓力篩選抗鹽堿突變體，以提高苜蓿愈傷組織對鹽堿的耐逆性。因此，在誘導前對脅迫愈傷組織的鹽堿濃度進行篩選，確定合適的鹽堿脅迫濃度。常采用鹽堿脅迫致死濃度作為處理濃度，對愈傷組織在含NaCl、NaHCO3和Na2CO3脅迫培養(yǎng)基上依據(jù)愈傷組織的存活率，確定苜蓿愈傷組織的致死濃度，NaCl、NaHCO3和Na2CO3脅迫的致死濃度均為200 mmol·L-1。這與趙邯鄲等[17]對玉米愈傷組織的耐鹽性篩選研究，確定愈傷組織適宜NaCl選擇壓為200 mmol·L-1的研究結果相同。低NaCl、NaHCO3鹽堿濃度對愈傷組織的存活率和生物量影響相對較小，高濃度對愈傷組織的存活率和生物量影響較大，Na2CO3脅迫對愈傷組織的存活率和生物量影響更大，與范小峰等[18]研究NaCl脅迫下唐古特白刺愈傷組織生物量變化存在一定的差異:前者研究高濃度(>200 mmol·L-1)NaCl脅迫愈傷組織生物量低于對照，而本研究中NaCl脅迫愈傷組織生物量均高于對照，可能是不同植物的耐受性不同。苜蓿具有一定適應鹽漬生境的能力，但對3種鹽堿的抗性存在一定的差異性。

3.2 NaN3誘變和鹽堿脅迫對苜蓿愈傷組織滲透相關生理代謝的影響

鹽堿等逆境對植物產(chǎn)生直接或間接的水分脅迫，使植物體內(nèi)主動積累各種有機物來提高細胞液濃度，降低細胞滲透勢，提高細胞保水力，以適應逆境脅迫作用，即為滲透調(diào)節(jié)。細胞內(nèi)合成的可溶性糖、脯氨酸等多種有機物質(zhì)是多種植物體內(nèi)最有效的滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)[19-21]。同時，植物在受到逆境脅迫時，膜透性發(fā)生改變，膜脂過氧化產(chǎn)物MDA含量和相對電導率增加，因此，MDA含量和相對電導率的高低與細胞膜的受傷害程度呈正相關。試驗結果顯示，在3種鹽堿脅迫的半致死濃度下，MDA含量和相對電導率均低于對照，可能是由于中苜1號對鹽堿具有一定的抗性，使3種滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)大量積累，降低了膜質(zhì)的過氧化程度和質(zhì)膜的透性，增強了質(zhì)膜應對逆境傷害程度的反應能力。與張玉霞等[22]研究鹽堿對蘆筍脅迫效應時所發(fā)現(xiàn)的，低濃度的中性鹽、堿性鹽和混合鹽處理均有利于蘆筍的生長，降低了MDA和電導率的含量等結果一致。

化學誘變對植物的生理代謝途徑和植物的抗逆性能產(chǎn)生一定的影響，溫日宇等[23]研究表明，NaN3能夠引起綠豆的生理損傷，在低濃度誘變下?lián)p傷效應隨濃度增加而提高。綜合分析本試驗的結果可以看出，NaN3誘變可以增強對細胞膜的保護能力，在應對鹽堿脅迫壓力下，苜蓿愈傷組織啟動防御機制，通過可溶性蛋白、可溶性糖、脯氨酸的積累調(diào)節(jié)細胞滲透勢，降低傷害程度，保護原生質(zhì)，減輕質(zhì)膜受鹽堿脅迫的傷害，防止細胞失水，保護生物大分子結構與功能的穩(wěn)定，緩解苜蓿愈傷組織抵御鹽堿脅迫帶來的傷害。從苜蓿愈傷組織的MDA和相對電導率的變化分析，鹽堿脅迫降低了愈傷組織MDA和相對電導率，在NaN3誘變下，苜蓿愈傷組織的MDA和相對電導率含量下降的幅度不同，說明在同一脅迫反應條件下，愈傷組織對不同鹽堿的反應不同。

試驗通過NaN3化學誘變和3種鹽堿選擇壓力的篩選，確定NaN3誘變半致死濃度為3.0 mmol·L-1，致死濃度為5.0 mol·L-1；NaCl和NaHCO3脅迫半致死濃度為150 mmol·L-1，Na2CO3脅迫半致死濃度為100 mmol·L-1，3種鹽堿脅迫致死濃度為200 mmol·L-1。一定濃度NaN3誘變可以提高苜蓿愈傷組織的脯氨酸、可溶性糖和可溶性蛋白的積累和降低MDA和相對電導率，以提高愈傷組織對NaCl、NaHCO3和Na2CO3的抵抗能力。