血清miRNA-370與頸動脈粥樣硬化微栓子形成間的關(guān)系研究

許宏俊，周春山，黃楚麗，陳蘭香 （廣東省普寧華僑醫(yī)院，廣東普寧 515300）

動脈粥樣硬化是一種動脈壁的慢性炎性病變。不穩(wěn)定性斑塊主要包含有泡沫細胞組成的脂質(zhì)核心和纖維帽，它可引起斑塊侵蝕或破裂，從而誘發(fā)血栓形成和急性心梗的發(fā)生。微栓子(MES)的形成是不穩(wěn)定性斑塊的重要特征。微小RNA(miRNA)是內(nèi)源性非編碼單鏈RNA小分子，可參與細胞的分化、增生、死亡以及各種生物組織的發(fā)育調(diào)節(jié)。近年循環(huán)miRNA被當做理想分子標記物用于疾病進展的評估。Gao等[5-6]研究也提示miR-370廣泛參與了動脈粥樣硬化及斑塊穩(wěn)定性的基因調(diào)控。本研究基于血清層面探索了miR-370同頸動脈粥樣硬化微栓子MES形成之間的關(guān)系，現(xiàn)將結(jié)果報道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

依據(jù)中華醫(yī)學會《老年人頸動脈粥樣硬化性疾病診治中國專家建議》的診斷標準[7]，選取2018年6-11月就診于我院并被確診為急性缺血性腦卒中(排除腦動脈炎、心源性腦梗塞等其他原因引起的腦梗死)且合并有不穩(wěn)定斑塊的患者135例，其中男76例，女59例，平均年齡(63.4±10.9) 歲。收集患者的臨床資料，包括性別、年齡、飲酒史、糖尿病史、體質(zhì)量指數(shù)、總膽固醇、甘油三酯、低密度脂蛋白、高密度脂蛋白及同型半光氨酸水平等。應用經(jīng)顱多普勒超聲檢查患者微栓子MES的情況，其中MES陽性73例(MES陽性組)，陰性62例(MES陰性組)。另選取同期我院60名健康體檢者作為對照組，其中男35名，女25名，平均年齡(62.3±11.2) 歲。研究對象均簽署知情同意書，且通過了我院倫理委員會審核。

1.2 方法

1.2.1 血液樣本的收集 所有研究對象于清晨空腹時采集靜脈血約8 mL，室溫下靜置半個小時后，于4℃ 1 500 r/min離心10 min，取上層血清置新的EP管，并放到-80 ℃超冷冰箱中保存，待測miR-370的表達水平。

1.2.2 頸動脈超聲檢查及MES的監(jiān)測 應用PHILIPS IE33彩色多普勒超聲診斷儀(探頭頻率7～12 MHz)仔細監(jiān)測管腔狹窄及斑塊形成情況，重點關(guān)注斑塊回聲特點及斑塊部位等。超聲探查時患者取仰臥位，頭部往后仰并偏向檢查面對側(cè)，由下到上依次探查頸總動脈、頸動脈竇部、頸外及頸內(nèi)動脈顱外段。采用Multi-DopX2型4門深通道TC儀(德國DWL公司生產(chǎn))監(jiān)測MES。探頭頻率為2 MHz。MES陽性識別標準參考2011年國際腦血管動力學會議共識[8]：(1)短時程持續(xù)時間＜300 ms；(2)高強度(較背景血流信號≥3 dB)；(3)單向出現(xiàn)于頻譜中；(4)伴有和諧的“噼啪音”或者“鳥鳴音”；(5)隨機出現(xiàn)在心動周期；(6)在兩個監(jiān)測深度有時間延遲。每個患者的MES監(jiān)測均由2名有經(jīng)驗的超聲科醫(yī)生共同判斷。

1.2.3 血清miR-135含量的檢測 實驗過程主要包括總RNA的抽提、逆轉(zhuǎn)錄反應及PCR。血清樣本均需放置于冰上操作。步驟依據(jù)各自對應的試劑盒說明書進行。實驗選擇U6作為內(nèi)參基因，miR-370的相對表達量用2-ΔΔCt表示，其中ΔCt=Ct miR-370-Ct U6，ΔΔCt=ΔCt(實驗組)-ΔCt(對照組)。

1.3 統(tǒng)計學處理

運用SPSS21.0統(tǒng)計學軟件對實驗數(shù)據(jù)進行分析。計量資料以均數(shù)±標準差表示，采用t檢驗、單因素方差分析及q檢驗；計數(shù)資料采用χ2檢驗。運用秩相關(guān)Spearman分析血清miR-370的表達量與血糖、血脂等指標間的關(guān)系。P＜0.05表示差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 頸動脈粥樣硬化MES陽性和陰性患者一般資料的比較

MES陽性組患者吸煙率、低密度脂蛋白和總膽固醇含量均高于MES陰性組，差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05或0.01)。兩組的體質(zhì)量指數(shù)、高密度脂蛋白和尿酸等差異無統(tǒng)計學意義(P＞0.05)。

表1 MES陽性和陰性患者一般資料的比較

2.2 miRNA-370在MES陽性、MES陰性和健康者血清中的表達水平

MES陽性和陰性組患者血清中miR-370的表達量均高于對照組，且MES陽性組更顯著，差異均有統(tǒng)計學意義(P＜0.01)。

2.3 血清miR-370與MES關(guān)系分析

為進一步分析血清miR-370與MES之間的關(guān)系，根據(jù)上調(diào)的中位倍數(shù)(3.05倍)分為miR-370高表達(＞3.05倍，68例)和低表達(≤3.05倍，67例)。如表2，MES陽性組中miR-370高表達者顯著多于MES陰性組(61.6%vs37.1%，P＜0.01)。

2.4 血清miR-370與血糖、血脂等指標的關(guān)系

表2 3組miRNA-370表達水平的比較

表3 血清miR-370與MES的關(guān)系 (例)

Spearman相關(guān)分析顯示，血清miR-370表達水平與低密度脂蛋白、總膽固醇、甘油三酯及同型半光氨酸水平呈正相關(guān)(P＜0.05或0.01)，而與年齡、體質(zhì)量指數(shù)、高密度脂蛋白、血糖及尿酸等無明顯相關(guān)性(P＞0.05)。

表4 血清miR-370與血糖、血脂等指標的相關(guān)性

3 討論

近年來MES領(lǐng)域的研究發(fā)展迅速，MES的發(fā)生不僅與頸動脈狹窄的嚴重程度、斑塊特征等密切相關(guān)，還與患者有無癥狀的出現(xiàn)有關(guān)。系統(tǒng)評價結(jié)果表明：無癥狀的頸動脈狹窄患者僅10%，有癥狀患者MES陽性率可達43%，且未來發(fā)生卒中的風險顯著增高[11]。目前經(jīng)顱多普勒仍是唯一并且有效的MES監(jiān)測方法，但其診斷價值高度依賴于操作人員的技術(shù)水平。因此，提高MES的檢出率，對降低頸動脈粥樣硬化患者腦卒中的發(fā)生，以及改善遠期預后具有重要意義。

本研究首先對MES陽性組和陰性組患者的基線資料進行比較，發(fā)現(xiàn)兩組的低密度脂蛋白和總膽固醇含量差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05或0.01)，提示MES的形成與患者血脂的關(guān)系密切。

MES形成是不穩(wěn)定斑塊的重要特征，血管生成與斑塊不穩(wěn)定性和破裂顯著相關(guān)[12]。 Gao等[5]發(fā)現(xiàn)miR-370廣泛參與調(diào)控平滑肌細胞的表型，在調(diào)控動脈的平滑肌細胞去分化和過渡增殖后，隨之造成的血管損傷后動脈粥樣硬化會引起血管堵塞。循環(huán)miRNA作為近年研究的熱點，已證實其作為生物標志物應用于臨床疾病診斷及生物學行為變化的價值。本研究重點關(guān)注了MES陽性及陰性患者血清中miR-370的表達差異以及兩者之間的關(guān)系，結(jié)果顯示MES陽性患者血清miR-370不僅顯著高于陰性患者，且亞組分析發(fā)現(xiàn)MES陽性組中miR-370高表達的患者例數(shù)亦明顯多于MES陰性組。另外，本研究觀察到miR-370表達與低密度脂蛋白、總膽固醇和甘油三酯等指標密切相關(guān)。血清miRNA因其具有無創(chuàng)傷、操作簡單及可重復性等優(yōu)點為MES的監(jiān)測提供了更為有力的輔助作用。

綜上所述，除了經(jīng)顱多普勒外，血清miR-370的檢測可更加高效地監(jiān)測MES，可作為頸動脈狹窄患者抗栓治療或頸動脈支架置入術(shù)的輔助性監(jiān)測指標。