小花清風藤不同藥用部位及溶劑提取物對四氯化碳致小鼠急性損傷的保護作用

李玉玲 李建橋 胡建忠 賀海波 鄒 坤 李 蓉 殷麗強 汪鋆植

(1.三峽大學 生物與制藥學院&天然產(chǎn)物研究與利用湖北省重點實驗室, 湖北 宜昌 443002； 2.水利部水土保持植物開發(fā)管理中心, 北京 100053)

小花清風藤(Sabia.ParvifloraWall.ex Roxb)為清風藤科清風藤屬藤本植物，主要分布于貴州、云南、廣西等地[1-3]，其莖根入藥治療急性黃疸型肝炎，清熱利濕并治療風濕勞傷[4-5]．本實驗用四氯化碳(CCl4)復制小鼠的肝損傷模型，觀察小花清風藤不同藥用部位及溶劑提取物對CCl4致小鼠急性損傷的保護作用，為今后進一步研究其保肝護肝作用及可能的作用機制奠定了基礎(chǔ)．

1 材料與方法

1.1 試驗藥物

小花清風藤莖和葉采自貴州省黔西南布依族苗族自治州興義市冊亨縣，植物標本現(xiàn)保存于該實驗室(標本編號：201700227)．小花清風藤莖、葉及莖葉自然混合物用水、50%乙醇和95%乙醇超聲提取后，濃縮干燥后，其莖經(jīng)水、50%乙醇和95%乙醇超聲提取和濃縮，干膏重量分別為20.0 g、11.23 g和20.0 g，1 g干膏相當于生藥量分別為10、17.8和10 g生藥；其葉經(jīng)水、50%乙醇和95%乙醇超聲提取和濃縮，干膏重量分別為36.02 g、45.64 g和12.00 g，1 g干膏相當于生藥量分別為5.5、4.4和16.7 g生藥；其莖和葉混合物經(jīng)水、50%乙醇和95%乙醇超聲提取和濃縮，干膏重量分別為24.72 g、20.14 g和15.00 g，1 g干膏相當于生藥量分別為8.1、9.9和13.3 g生藥．水飛薊素膠囊(德國馬博士大藥廠，批號：150214，規(guī)格：140 mg/顆)．

1.2 實驗動物

選擇野生型KM小鼠168只，雄性，6～8周齡，體重18～20 g，購于三峽大學實驗動物中心并飼養(yǎng)于SPF級動物室，許可證號：SCXK(鄂)2011-0012．

1.3 試劑

CCl4(分析純)：成都市科龍化工試劑廠；歐麗微蘭橄欖油：廣州市糧油工業(yè)有限公司；谷丙轉(zhuǎn)氨酶(ALT)試劑盒、谷草轉(zhuǎn)氨酶(AST)試劑盒、谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-Px)、超氧化物歧化酶(SOD)、丙二醛(MDA)：南京建成生物工程研究所；蛋白定量檢測試劑盒：南京建成生物工程研究所；其他試劑均為分析純．

1.4 儀器

電子分析天平：中國上海梅特勒-托利多有限公司；臺式高速離心機：德國Eppendof公司；Tecan多功能酶標儀：瑞士TECAN集團公司．脫水機：德國Leica公司；超薄切片機：奧地利萊卡公司；攤片烤片機：孝感市宏業(yè)醫(yī)用儀器有限公司；多功能顯微鏡及圖像分析系統(tǒng)：德國Leica公司．

1.5 實驗方法

1.5.1 CCl4橄欖油溶液的配置

用移液器分別取0.5 mL的CCl4加入橄欖油定容至50 mL，混合均勻，配置體積分數(shù)為0.5%的CCl4橄欖油溶液，于通風櫥操作，現(xiàn)配現(xiàn)用．

1.5.2 實驗分組及給藥

取昆明雄性小鼠共168只，隨機分為21組，每組8只，即正常組、CCl4模型組、水飛薊素組(200 mg/kg)、水提取組(莖、葉、莖葉自然混合)低、高劑量組、50%乙醇提取組(莖、葉、莖葉自然混合)低、高劑量組、95%乙醇提取組(莖、葉、莖葉自然混合)低、高劑量組．正常組灌胃給予等體積的0.5%羧甲基纖維素鈉(CMC-Na)，其余組均按20 mL/kg灌胃給藥，每日1次，連續(xù)7 d．于末次給藥后2 h，除正常組實驗小鼠腹腔注射橄欖油外，其余各組均按10 mL/kg的劑量腹腔注射0.5%的CCl4橄欖油溶液．實驗期間自由飲水和進食．

1.5.3 實驗小鼠行為及體征觀察

每天觀察實驗小鼠的活動、進食、精神狀態(tài)、毛發(fā)、排泄物及死亡情況．

1.5.4 肝臟質(zhì)量的稱量和指數(shù)的計算

實驗小鼠眼眶取血完畢后，取肝臟進行稱量，計算其質(zhì)量指數(shù)．

1.5.5 肝組織中ALT和AST活性測定

取肝臟組織用生理鹽水進行組織勻漿后，用離心機離心15 min后，收集上清液，用多功能酶標儀檢測肝組織中ALT和AST含量．具體方法按照試劑盒中說明書進行．

1.5.6 肝組織中SOD、GSH-Px活性和MDA含量的測定

取肝臟勻漿上清液測肝組織中SOD、GSH-Px活性和MDA含量．具體方法按照試劑盒中說明書進行．

1.5.7 肝組織病理形態(tài)學分析

取血完畢后，取小鼠肝組織，經(jīng)4%多聚甲醛溶液固定，不同乙醇梯度脫水，常規(guī)石蠟進行切片包埋，經(jīng)HE染色后，在光鏡下觀察結(jié)肝組織病理學變化．

1.6 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析

2 結(jié) 果

1)小花清風藤不同藥用部位及溶劑提取物對CCl4致小鼠行為和體征的影響如下：

在CCl4致急性肝損傷的小鼠模型制作過程中，正常組小鼠皮毛緊密、有光澤，活潑，飲食及二便均正常；模型小鼠給予CCl4后出現(xiàn)被毛松散，懶動；小花清風藤的莖、葉及莖葉自然混合物用水(莖水提物：SJ，葉水提物：SY，莖葉自然混合物水提物：SJY)、50%乙醇(莖50%乙醇提物：50%AJ，葉50%乙醇提物：50%AY，莖葉自然混合物50%乙醇提物：50%AJY)和95%乙醇(莖95%乙醇提物：95%AJ，葉95%乙醇提物：95%AY，莖葉自然混合物95%乙醇提物：95%AJY)提取物治療后，均有不同程度的改善．在小花清風藤不同藥用部位及溶劑提取物中，以SJY作用效果最好，95%AJY和50%AY效果次之．

2)小花清風藤不同藥用部位及溶劑提取物對CCl4致小鼠急性肝損傷模型肝質(zhì)量及質(zhì)量指數(shù)的影響，見表1～3．

表1 水提取物對CCl4致小鼠急性肝損傷模型肝質(zhì)量及質(zhì)量指數(shù)的影響

與正常組比較，#P<0.05,##P<0.01；與模型組比較，*P<0.05,**P<0.01

表2 50%乙醇提取物對CCl4致小鼠急性肝損傷模型肝質(zhì)量及質(zhì)量指數(shù)的影響

與正常組比較，#P<0.05,##P<0.01；與模型組比較，*P<0.05,**P<0.01

表3 95%乙醇提取物對CCl4致小鼠急性肝損傷模型肝質(zhì)量及質(zhì)量指數(shù)的影響

續(xù)表3

與正常組比較，#P<0.05,##P<0.01；與模型組比較，*P<0.05,**P<0.01

由表1～3可見，模型組小鼠的肝質(zhì)量及肝質(zhì)量指數(shù)明顯增加，與正常組比較具有顯著性差異(P<0.01)；用小花清風藤的莖、葉及莖葉自然混合物的水、50%乙醇和95%乙醇提取物治療后，均有不同程度的降低．在小花清風藤不同藥用部位及溶劑提取物中，以SJY、SJ和50%AJY作用效果最為顯著，與模型組比較，差異有顯著和非常顯著性意義(P<0.05或P<0.01)．

3)小花清風藤不同藥用部位及溶劑提取物對CCl4致小鼠急性肝損傷模型肝組織中轉(zhuǎn)氨酶活性的影響，見表4～6．

表4 水提取物對ALT、AST活性的影響

與正常組比較，#P<0.05,##P<0.01；與模型組比較，*P<0.05,**P<0.01

表5 50%乙醇提取物對ALT、AST活性的影響

與正常組比較，#P<0.05,##P<0.01；與模型組比較，*P<0.05,**P<0.01

表6 95%乙醇提取物對ALT、AST活性的影響

與正常組比較，#P<0.05,##P<0.01；與模型組比較，*P<0.05,**P<0.01

由表4～6可見，模型組小鼠肝組織中ALT和AST活性顯著升高，以ALT升高較為明顯，與正常組比較具有顯著性差異(P<0.01)；用小花清風藤的莖、葉及莖葉自然混合物的水、50%乙醇和95%乙醇提取物治療后，ALT和AST活性均有不同程度的降低，尤其是ALT改善效果最為明顯．在小花清風藤不同藥用部位及溶劑提取物中，以SJY、95%AJY和50%AJY作用效果最為顯著，與模型組比較，差異有顯著和非常顯著性意義(P<0.05或P<0.01)．

4)小花清風藤不同藥用部位及溶劑提取物對CCl4致小鼠急性肝損傷模型肝組織形態(tài)學的影響，如圖1～3所示．

A：正常組；B：模型組；C：水飛薊素組；D：SJ-L組；E：SJ-H組；F：SY-L組；G：SY-H組；H：SJY-L組；I：SJY-H組圖1 水提取物對CCl4致小鼠急性肝損傷模型肝組織病理學的影響

鏡下組織學觀察：正常組小鼠肝組織結(jié)構(gòu)正常，肝小葉結(jié)構(gòu)較為清楚，以中央靜脈為中心的肝細胞呈放射狀排列，肝索排列規(guī)則有序，肝竇、匯管區(qū)成纖維細胞少．模型組小鼠肝組織可見脂肪變性，肝細胞腫

A：正常組；B：模型組；C：水飛薊素組；J：50%AJ-L組；K：50%AJ-H組；L：50%AY-L組；M：50%AY-H組；N：50%AJY-L組；O：50%AJY-H組圖2 50%乙醇提取物對CCl4致小鼠急性肝損傷模型肝組織病理學的影響

A：正常組；B：模型組；C：水飛薊素組；P：95%AJ-L組；Q：95%AJ-H組；R：95%AY-L組；S：95%A Y-H組；T：95%AJY-L組；U：95%AJY-H組圖3 95%乙醇提取物對CCl4致小鼠急性肝損傷模型肝組織病理學的影響

脹，間界限不清，呈現(xiàn)彌漫性小泡性脂變，胞質(zhì)中可見脂肪滴，細胞核位于細胞質(zhì)邊緣；肝小葉和匯管區(qū)可見炎癥細胞浸潤，肝竇、匯管區(qū)成纖維細胞增多，與正常組比較有顯著性差異(P<0.01)；SY、50%AY和95%AY組肝內(nèi)雖可見片狀壞死或點狀壞死，但壞死程度和模型組相比無明顯差異(P>0.05)；50%AJ和95%AJ組肝內(nèi)偶見點狀壞死，壞死程度比模型組明顯減輕，與模型組比較有顯著性差異(P<0.05)；SJY、SY、50%AJY和95%AJY組肝細胞損傷和壞死程度顯著減輕，與模型組比較有顯著性差異(P<0.01)．

5)小花清風藤莖葉藥用部位不同溶劑提取物對CCl4致小鼠急性肝損傷模型肝組織中SOD、GSH-Px活性和MDA含量的影響，見表7．

表7 不同溶劑提取物對CCl4致小鼠急性肝損傷模型肝組織中SOD、GSH-Px活性和MDA含量的影響

與正常組比較，#P<0.05,##P<0.01；與模型組比較，*P<0.05,**P<0.01

由表7可見，模型組中SOD和GSH-Px活性明顯下降，MDA含量明顯升高，以SOD上升較為明顯，與正常組比較具有顯著性差異(P<0.01)；用SJY、50%AJY和95%AJY治療后，SOD和GSH-Px活性均有不同程度的升高，MDA含量有不同程度降低，尤其是對MDA的改善效果最為明顯．在小花清風藤不同藥用部位及溶劑提取物中，以SJY的作用效果最為顯著，與模型組比較，差異有顯著和非常顯著性意義(P<0.05或P<0.01)．

3 討 論

CCl4等多種毒性物質(zhì)所引起的肝損傷以及病毒性肝炎的病理學機制與自由基的生成造成脂質(zhì)過氧化有關(guān)，故自由基清除劑有可能拮抗其肝毒性[6-7]．

已有研究表明，小花清風藤對病毒性肝炎和急性肝損傷具有較好的療效，但是何種有效組分(成分)發(fā)揮療效，目前尚未完全弄清楚．在實驗中發(fā)現(xiàn)小鼠經(jīng)CCl4損傷后，小鼠肝組織中ALT和AST均明顯升高；用小花清風藤的莖、葉及莖葉混合物的水、50%乙醇和95%乙醇提取物治療后，ALT和AST活性均有不同程度的降低，尤其是ALT改善效果最為明顯．在小花清風藤不同藥用部位及溶劑提取物中，以SJY、95%AJY和50%AJY作用效果最為顯著．實驗提示小花清風藤具有一定的保護肝臟活性并且莖葉混合物部位作用較強，呈現(xiàn)出較好的量效關(guān)系．病理形態(tài)學觀察到模型組肝小葉結(jié)構(gòu)不完整，肝細胞結(jié)構(gòu)損傷較嚴重，小花清風藤莖葉水提取部位組對小鼠的肝損傷有明顯減輕，肝細胞結(jié)構(gòu)趨于完整，氣球樣肝細胞難以見到，炎性細胞浸潤很少，顯示其有明顯的抗肝損傷作用．

ROS可被生物體內(nèi)SOD清除，從而減輕其對細胞造成的損傷．谷胱甘肽是細胞內(nèi)含量最豐富的非蛋白巰基，在體內(nèi)主要以GSH和GSSG存在，肝臟是其體內(nèi)合成的主要場所[8-11]．研究結(jié)果顯示，經(jīng)CCl4處理后，模型組小鼠肝組織中SOD和GSH-Px活性降低顯著，而MDA含量明顯升高；用小花清風藤的莖葉混合物的水、50%乙醇和95%乙醇提取物治療后，SOD和GSH-Px活性均有不同程度的升高，MDA有不同程度降低，尤其是MDA的改善效果最為明顯．在小花清風藤不同藥用部位及溶劑提取物中，以SJY的作用效果最為顯著．上述實驗結(jié)果與肝組織形態(tài)學結(jié)果相一致．

綜上所述，小花清風藤對CCl4致小鼠急性肝損傷具有顯著的保護作用，可減輕CCl4對肝臟的脂質(zhì)過氧化損傷，降低肝組織中ALT和AST活性，升高肝組織中SOD和GSH-Px含量，降低肝組織中MDA含量，從而減輕CCl4對肝組織氧化應激損傷，改善肝臟病理組織學形態(tài)，保護肝細胞從而恢復肝功能，并驗證其作用機制與其抗氧化作用有關(guān)．在小花清風藤水提取組低、高劑量組、50%乙醇提取組低、高劑量組、95%乙醇提取組中，以SJY作用效果比較好，依次是50%AJY、95%AJY、SJ、50%AJ、95%AJ、SY、50%AY、95%AY，且呈現(xiàn)明顯的量效關(guān)系．