干旱脅迫下小麥穎果內(nèi)源激素的變化及其與胚乳發(fā)育的關(guān)系

陳昕鈺，陳銘鑫，楊 陽，李 波,2，董召娣，汪巧菊，余徐潤，熊 飛

(1.揚(yáng)州大學(xué)生物科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，江蘇揚(yáng)州 225009； 2.江蘇沿江地區(qū)農(nóng)業(yè)科學(xué)研究所，江蘇南通 226541)

干旱是小麥生產(chǎn)中常遇到的自然災(zāi)害之一，它通過影響植株形態(tài)結(jié)構(gòu)、生理生化及基因調(diào)控，最終影響產(chǎn)量和品質(zhì)[1]。小麥在營養(yǎng)生長和生殖生長過程中都極易受干旱脅迫的影響，其中開花期和灌漿期干旱對小麥產(chǎn)量的影響最大[2]。胚乳是穎果的主要組織結(jié)構(gòu)，淀粉和蛋白質(zhì)作為主要儲藏物質(zhì)，分別以淀粉體和蛋白體的形式積累于胚乳細(xì)胞[3]。胚乳細(xì)胞的分裂、發(fā)育以及其中淀粉和蛋白質(zhì)的充實度，直接決定小麥的產(chǎn)量和品質(zhì)[4]。前人觀察了干旱脅迫下小麥穎果組織的結(jié)構(gòu)特征，并研究了干旱對胚乳淀粉和蛋白質(zhì)積累的影響[5-6]。Singh等[7]研究發(fā)現(xiàn)干旱脅迫會降低小麥B-型淀粉粒的比例和直鏈淀粉的含量。Zhang等[8]指出干旱脅迫下小麥穎果中醇溶蛋白和清蛋白含量有所增加。

植物激素是由自身代謝合成的一類有機(jī)分子，在植物生長發(fā)育和響應(yīng)逆境脅迫中發(fā)揮著重要的調(diào)控作用[9]。干旱脅迫下植物內(nèi)源激素的含量和活性發(fā)生改變，從而調(diào)控生理生化過程以及同化產(chǎn)物的運(yùn)輸分配以適應(yīng)干旱[10]。有研究表明，為響應(yīng)干旱脅迫，植物中脫落酸(ABA)和細(xì)胞分裂素(CTK)含量會發(fā)生變化，其中ABA的濃度在植物葉片、花器官和發(fā)育的籽粒中均顯著增加[11-12]。張 煒等[13]研究不同激素間的協(xié)同調(diào)控作用，發(fā)現(xiàn)干旱脅迫下小麥幼苗的根、葉片和葉鞘中的ABA、生長素(IAA)的含量均有所增加，二者協(xié)同調(diào)控氣孔關(guān)閉和根系生長。

前人關(guān)于干旱脅迫對小麥激素影響的研究較多。Lu等[14]認(rèn)為干旱條件下抗旱小麥葉片中能積累更多的ABA；Guoth等[15]觀察發(fā)現(xiàn)，發(fā)生滲透脅迫時干旱敏感型小麥根部的ABA含量較高；Westgate等[16]發(fā)現(xiàn)干旱條件下小麥花器官中的ABA含量可增加10～15倍。前人的這些研究主要集中在小麥根、葉以及花器官上，然而有關(guān)干旱脅迫下小麥穎果內(nèi)源激素含量變化的研究鮮有報道，關(guān)于干旱脅迫下穎果激素變化與胚乳細(xì)胞發(fā)育的關(guān)系尚不清楚。因此，本研究以小麥品種揚(yáng)麥16為材料，在幼苗返青至穎果成熟階段進(jìn)行干旱處理，采集不同發(fā)育時期的小麥穎果，采用樹脂切片及顯微觀察等技術(shù)，從顯微水平觀察干旱脅迫下小麥胚乳細(xì)胞發(fā)育的結(jié)構(gòu)特征；同時，采用酶聯(lián)免疫吸附法測定激素含量，研究干旱脅迫下小麥穎果內(nèi)源激素的變化規(guī)律及其與胚乳細(xì)胞發(fā)育的關(guān)系，以期為明確干旱誘導(dǎo)激素調(diào)控的穎果發(fā)育機(jī)制及小麥產(chǎn)量和品質(zhì)提升提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 供試材料及處理

試驗于2015年10月至2016年5月在揚(yáng)州大學(xué)江蘇省作物栽培重點實驗室試驗棚內(nèi)進(jìn)行。供試小麥品種為揚(yáng)麥16，由揚(yáng)州大學(xué)農(nóng)學(xué)院提供。采用盆栽方式進(jìn)行。土壤為砂壤土，基肥含有機(jī)質(zhì)24.5 g·kg-1，速效氮106 mg·kg-1，有機(jī)磷33.8 mg·kg-1，速效鉀66.4 mg·kg-1。10月29日播種， 每盆播種20粒，2周后間苗，每盆保留8株。在小麥花期用記號筆標(biāo)記開花的穎殼并給植株掛牌以確定開花日期，標(biāo)記的穎花均為穗中部小穗基部的2朵小花。

干旱處理方式為全生育時期干旱，即從幼苗返青期開始到穎果成熟的整個生育階段內(nèi)嚴(yán)格控制澆水量，并采用負(fù)壓式水勢計(SP-11,ISSCAS,China)檢測距地表15 cm的土壤水勢，使正常水分組和干旱脅迫組的土壤水勢分別維持在-20 kPa和-60 kPa左右。每處理30盆，整個生育過程中2個處理組的施肥、除草及防蟲害等管理措施均一致。

1.2 穎果千粒重、可溶性糖含量、總淀粉含量以及蛋白質(zhì)含量的測定

采集成熟小麥籽粒，測定新鮮穎果的千粒重，然后將其置于鼓風(fēng)干燥箱，105 ℃殺青1 h，42 ℃烘至恒重。將干燥的小麥籽粒研磨成粉末，過100目金屬網(wǎng)篩，備用。稱取200 mg粉末，采用蒽酮比色法[17]測定可溶性糖和總淀粉含量，采用凱氏定氮法[17]測定蛋白質(zhì)含量。

1.3 穎果組織化學(xué)染色及體視顯微鏡觀察

選取不同發(fā)育天數(shù)的穎果，在體視顯微鏡(MZ6,Leica,Germany)下觀察穎果的形態(tài)并拍照。同時，將穎果從中間部位橫切，用I2/KI(0.3% I2+1% KI)染液染色30 s后于體視顯微鏡下拍照。

1.4 穎果組織樹脂切片觀察

采集不同發(fā)育時期的穎果，用潔凈的剃須刀片橫向切取穎果中部2 mm厚的片段并迅速置于2.5%戊二醛溶液固定48 h。樣品經(jīng)磷酸緩沖液漂洗后再經(jīng)梯度乙醇脫水、環(huán)氧丙烷置換、Spurr低黏度樹脂浸透與包埋，70 ℃聚合12 h。將聚合后的樣品用玻璃刀在超薄切片機(jī)(Ultracut R,Leica,Germany)上切1 μm的半薄切片，0.5%甲基紫溶液染色，再通過裝有CCD相機(jī)的光學(xué)顯微鏡(DMLS,Leica,Germany)觀察并拍照。每處理選取3個穎果作為重復(fù)，各穎果均來自不同麥穗。

1.5 胚乳及其充實物質(zhì)數(shù)量特征統(tǒng)計

按照Chen等[18]的方法，通過Photoshop軟件(Version CS6,Adobe,USA)處理拍攝的顯微圖像，用Image-Pro Plus圖像分析軟件(Version 6.0,Media Cybernetics,USA)統(tǒng)計胚乳細(xì)胞數(shù)目、胚乳橫截面積以及胚乳細(xì)胞中淀粉體和蛋白體的相對面積。

1.6 穎果內(nèi)源激素含量測定

采用酶聯(lián)免疫吸附法[19]測定小麥穎果中生長素(IAA)、脫落酸(ABA)、赤霉素(GA3、GA4)、玉米素核苷(ZR)和二氫玉米素核苷(DHZR)的含量。

1.7 數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析

采用Microsoft Excel 2016和 SPSS 19.0軟件統(tǒng)計分析數(shù)據(jù)，用t測驗進(jìn)行顯著性分析；采用Photoshop和Origin 9.1軟件制圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 干旱脅迫下小麥穎果的生長發(fā)育

正常水分下，小麥穎果在發(fā)育前期形態(tài)變化較大，穎果子房不斷縱向膨脹生長，在花后11 d時幾乎達(dá)到最大值，在該階段，穎果表面呈乳白色；隨后，穎果橫向加寬生長，表面顏色逐漸變綠；到了花后23～32 d，穎果基本成型，無明顯形態(tài)變化，表面顏色逐漸變黃；花后35 d，穎果成熟，脫水變硬。另外，從穎果橫切的I2/KI染色結(jié)果可以看出，在花后5 d前，果皮被染成黑色而胚乳組織幾乎未被染色；之后，隨穎果發(fā)育，胚乳逐漸被染成黑色并不斷加深，而果皮逐漸變薄，I2/KI染色后的顏色逐漸慢慢消失(圖1A)。說明在穎果發(fā)育過程中胚乳淀粉的積累量不斷增加，而果皮淀粉逐漸降解。遭受干旱脅迫后，穎果的形態(tài)發(fā)育過程與正常水分下基本一致，但干旱會加快穎果的發(fā)育進(jìn)程，促進(jìn)穎果提前成熟；花后29 d后，穎果發(fā)育成熟，成熟時間早于正常水分下發(fā)育同時期的穎果；同時，隨著干旱脅迫時間的持續(xù)，在發(fā)育后期，干旱脅迫下的小麥穎果體積明顯變小，成熟穎果表面皺縮，發(fā)育不良(圖1B)。另外，干旱脅迫下穎果橫切的I2/KI染色結(jié)果與正常水分處理間無明顯差別。

A:正常水分下小麥穎果形態(tài)發(fā)育和橫切面I2/KI染色；B:干旱脅迫下小麥穎果形態(tài)發(fā)育和橫切面I2/KI染色。圖下方的數(shù)字為穎果發(fā)育天數(shù)。

分析成熟小麥穎果千粒重以及可溶性糖、總淀粉和蛋白質(zhì)含量，發(fā)現(xiàn)干旱脅迫下成熟小麥穎果的千粒重為46.69 g，較正常水分處理低20.00%，差異顯著(P<0.05)；同時，其可溶性糖含量和總淀粉含量分別較正常水分處理低35.29%和2.80%，而蛋白質(zhì)含量較正常水分處理高8.40%，說明干旱脅迫在降低小麥穎果質(zhì)量的同時還能顯著影響主要儲藏物質(zhì)(糖類和蛋白)的積累。

2.2 干旱脅迫下胚乳細(xì)胞結(jié)構(gòu)的發(fā)育

小麥胚乳的發(fā)育過程主要包括胚乳細(xì)胞的分裂、生長以及胚乳細(xì)胞中淀粉和蛋白的充實。在花后5 d，胚乳細(xì)胞仍具有分裂能力，細(xì)胞核明顯且細(xì)胞中已經(jīng)積累了少量的小淀粉體。干旱脅迫下，小麥胚乳中存在更多的細(xì)胞核和淀粉體，細(xì)胞分裂旺盛(圖2A和圖2C)，且其胚乳細(xì)胞數(shù)目以及胚乳面積也顯著多于或高于正常水分處理(圖3A和圖3B)。說明，干旱脅迫能促進(jìn)穎果發(fā)育早期胚乳細(xì)胞的分裂和生長。

花后10 d，胚乳淀粉的積累量增多，體積變大，正常水分和干旱脅迫的小麥胚乳細(xì)胞中積累了小蛋白體，且兩者的蛋白體相對面積無顯著差異，但遭受干旱脅迫的小麥胚乳細(xì)胞中淀粉體的數(shù)量較多，淀粉體相對面積顯著大于正常水分處理(圖2B和圖2D；圖3C和圖3D)。另外，干旱脅迫下的小麥胚乳數(shù)目和胚乳面積均顯著少于或小于正常水分處理(圖3A和圖3B)，說明，隨干旱時間持續(xù)，胚乳細(xì)胞的進(jìn)一步分裂和擴(kuò)張受到抑制，同時也影響了淀粉的充實。

花后15 d，胚乳細(xì)胞的分裂和胚乳細(xì)胞化基本完成，細(xì)胞數(shù)目穩(wěn)定，穎果灌漿達(dá)到高峰，胚乳淀粉進(jìn)一步充實，并且在胚乳細(xì)胞中積累了蛋白體。正常水分和干旱脅迫下小麥的胚乳細(xì)胞數(shù)目無顯著差異，但干旱脅迫下小麥的胚乳面積顯著小于正常水分處理(圖3A和圖3B)，說明干旱脅迫能阻礙胚乳細(xì)胞的擴(kuò)張生長。同時，正常水分下小麥胚乳淀粉的充實度優(yōu)于干旱脅迫，干旱脅迫下胚乳細(xì)胞中淀粉體的數(shù)量較少，淀粉體相對面積顯著小于正常水分處理(圖2E、圖2H和圖3C)。但與正常水分處理相比，干旱脅迫下小麥胚乳細(xì)胞中積累的蛋白體數(shù)量較多，尺寸大，蛋白體的相對面積也較大(圖2E、圖2H和圖3D)。

花后20 d，正常水分下小麥的胚乳細(xì)胞基本被淀粉體充實，蛋白體游離分布于淀粉體間隙中。而干旱脅迫下小麥的胚乳細(xì)胞未完全充實，在淀粉體間存在較大的空隙，積累了一些大的蛋白體(圖2F,圖2I)。與正常水分處理相比，干旱脅迫下胚乳細(xì)胞中淀粉體的相對面積無顯著變化，但蛋白體的相對面積顯著增加(圖3C和圖3D)。

花后25 d，胚乳細(xì)胞完全被充滿，并且淀粉體相互擠壓變形，蛋白體體積增大，充實于淀粉體間隙。干旱脅迫下小麥胚乳細(xì)胞中蛋白體的積累量增加，蛋白體的相對面積顯著大于正常水分處理，并且一些小的蛋白體聚集在一起，形成了較大的蛋白體(圖2G、圖2J)。

以上結(jié)果表明，在穎果發(fā)育早期，干旱脅迫能促進(jìn)胚乳細(xì)胞的分裂和生長，加速胚乳發(fā)育。但隨干旱時間持續(xù)，胚乳細(xì)胞的進(jìn)一步擴(kuò)張受到抑制。同時，干旱脅迫阻礙了胚乳細(xì)胞中淀粉體的充實，但提高了蛋白體的積累量。

2.3 干旱脅迫下穎果內(nèi)源激素含量的變化

由圖4A可知，小麥穎果從花后發(fā)育至灌漿成熟階段IAA含量的變化呈單峰曲線。從花后5 d開始，IAA含量持續(xù)升高，到花后25 d達(dá)到最大值，之后隨穎果成熟其IAA含量快速下降。在穎果發(fā)育前期，干旱脅迫下小麥穎果的IAA含量顯著高于正常水分處理，且花后15 d時兩者差距達(dá)到最大(為11.42%)，但花后25 d后，其IAA含量顯著低于正常水分處理。說明干旱脅迫能提高小麥發(fā)育前期穎果的IAA含量，促進(jìn)穎果的前期發(fā)育。

無論是干旱脅迫還是和正常水分處理，小麥穎果的ABA含量均呈先升后降的變化趨勢(圖4B)。在穎果發(fā)育早期ABA含量快速增加，在花后10 d達(dá)到最大值，之后隨灌漿持續(xù)和籽粒成熟而逐漸降低?；ê? d，干旱脅迫處理下小麥穎果的ABA含量較正常水分處理提高了40.15%，且在之后整個穎果的發(fā)育過程中，其ABA含量一直顯著高于正常水分處理。表明干旱脅迫能提高穎果中ABA的積累，從而發(fā)揮ABA的生理作用，調(diào)控小麥對干旱的響應(yīng)。

A、B、E、F、G分別為正常水分下小麥穎果花后5、10、15、20、25 d的胚乳結(jié)構(gòu)；C、D、H、I、J分別為干旱脅迫下小麥穎果花后5、10、15、20、25 d的胚乳結(jié)構(gòu)；Nu：細(xì)胞核；SG：淀粉體；PB：蛋白體。

隨小麥穎果發(fā)育，GA3含量逐漸下降，GA4含量則呈先升后降的變化趨勢，且于花后20 d時達(dá)到最大值(圖4C和圖4D)。在發(fā)育早期，干旱脅迫下小麥穎果的GA3含量略高于正常水分處理，花后15 d之后略低于正常水分處理，但兩者間的差異始終未達(dá)到顯著水平。而干旱脅迫下小麥穎果的GA4含量在花后15 d之前顯著高于正常水分處理，隨后則顯著降低。

小麥穎果的ZR含量隨發(fā)育過程推進(jìn)呈先升后降的變化趨勢，在發(fā)育早期，干旱脅迫下穎果的ZR含量顯著高于正常水分處理，且在花后5 d時較正常水分處理高13.23%；花后15～25 d，干旱脅迫下小麥穎果的ZR含量顯著低于正常水分處理(圖4E)。

DHZR含量隨小麥穎果發(fā)育呈逐漸下降的變化趨勢，花后5 d，小麥穎果的DHZR含量最高，且干旱脅迫下穎果的DHZR含量較正常水分處理高5.14%(P<0.05)；之后，隨穎果發(fā)育，DHZR含量逐漸下降，在花后15～20 d，干旱脅迫穎果中的DHZR含量顯著低于正常水分處理(圖4F)。

綜上所述，在穎果發(fā)育過程中各類激素的變化規(guī)律各不相同，并且對干旱脅迫的響應(yīng)也不一致。干旱脅迫下，小麥穎果的IAA、GA3、GA4、ZR和DHZR含量在發(fā)育前期均高于正常水分處理，發(fā)育后期則低于后者。但在穎果整個發(fā)育過程中，干旱脅迫下小麥穎果ABA含量始終高于正常水分處理。

3 討 論

內(nèi)源性激素作為植物逆境脅迫的響應(yīng)因子，在應(yīng)對干旱脅迫時發(fā)揮重要作用。植物在干旱脅迫下會引起自身內(nèi)源激素含量和活性的改變，從而調(diào)控植物的生理生化過程以及同化產(chǎn)物的運(yùn)輸和分配[10]。ABA作為主要的內(nèi)源性激素之一，在植物的抗逆生長，尤其是在水分脅迫下具有重要的調(diào)控作用，甚至被認(rèn)為是衡量作物抗旱性的潛在指標(biāo)。ABA參與調(diào)控植物生長發(fā)育中的各種生理過程，包括氣孔開閉、種子發(fā)育、胚胎形態(tài)建成以及蛋白等儲藏物質(zhì)的合成[20]。普遍認(rèn)為，干旱脅迫能夠顯著提高ABA含量，在導(dǎo)致生理變化的同時調(diào)控多種脅迫應(yīng)答基因的表達(dá)，如LEA蛋白、脫水蛋白、擴(kuò)展蛋白等脅迫應(yīng)答蛋白[21]。研究表明，小麥在遭受干旱脅迫時，首先在根部快速合成ABA，之后通過木質(zhì)部和韌皮部運(yùn)輸至各營養(yǎng)器官和生殖組織，導(dǎo)致穎果中ABA含量升高，并通過調(diào)控細(xì)胞分裂、碳代謝酶活性等相關(guān)基因的表達(dá)，影響穎果的生長發(fā)育[22]。本研究中，干旱脅迫提高了穎果整個發(fā)育過程中的ABA含量，且干旱脅迫能促進(jìn)穎果的早期發(fā)育，抑制后期發(fā)育，這可能是由干旱誘導(dǎo)的穎果中高含量ABA調(diào)控不同的生理過程造成的。在穎果發(fā)育早期，ABA含量升高誘導(dǎo)擴(kuò)展蛋白表達(dá)上調(diào)，擴(kuò)展蛋白活性提高，促進(jìn)細(xì)胞的伸長生長[23]，因此穎果發(fā)育加快，導(dǎo)致胚乳面積增加。隨穎果的發(fā)育，干旱誘導(dǎo)的高ABA含量主要從3個方面影響穎果生長：首先，ABA能通過抑制細(xì)胞周期相關(guān)基因的表達(dá)阻礙胚乳細(xì)胞的分裂[24]；其次，ABA能誘導(dǎo)氣孔關(guān)閉，降低光合作用，減少碳水化合物的供應(yīng)比率，進(jìn)而導(dǎo)致穎果儲藏物質(zhì)積累的下降[25]；再者，ABA能通過影響碳水化合物催化酶活性擾亂穎果中的碳代謝[26]。總之，不論是在穎果發(fā)育的早期還是后期，ABA調(diào)控穎果發(fā)育對干旱脅迫響應(yīng)的最終目標(biāo)是達(dá)到保證自身存活和生產(chǎn)力的最佳平衡。

*表示干旱脅迫處理與對照之間在0.05水平下差異顯著。下圖同。

圖4 干旱脅迫下小麥穎果中內(nèi)源激素含量的變化

小麥穎果發(fā)育受內(nèi)源激素的調(diào)控，籽粒的形態(tài)建成以及灌漿充實過程均有內(nèi)源激素的參與[27]。諸多研究認(rèn)為，IAA和GAs與同化物的調(diào)運(yùn)密切相關(guān)，參與調(diào)控了同化物質(zhì)在籽粒庫中的積累和轉(zhuǎn)化[28]。閆 潔等[29]研究認(rèn)為，較高的IAA含量有利于光合產(chǎn)物向籽粒轉(zhuǎn)運(yùn)，加快灌漿速率。Pharis和King[30]的研究指出，GAs的生化合成及含量的動態(tài)變化與穎果的發(fā)育進(jìn)程一致。本研究中，在穎果發(fā)育前期，干旱脅迫誘導(dǎo)IAA和GA4的積累，加快發(fā)育進(jìn)程，表現(xiàn)出胚乳淀粉積累的增加。而到發(fā)育后期，干旱脅迫抑制穎果中IAA和GA4的積累，從而阻礙了同化物向穎果的轉(zhuǎn)運(yùn)，這與干旱脅迫下胚乳細(xì)胞淀粉充實度不佳的結(jié)果一致。前人研究表明，較高的GA3含量會增強(qiáng)α-淀粉酶等水解酶活性[31]，而本研究中，隨穎果發(fā)育其GA3含量逐漸下降，且干旱脅迫提高了穎果發(fā)育早期的GA3含量。這可能是因為在穎果早期發(fā)育中果皮發(fā)育占主導(dǎo)，而干旱誘導(dǎo)GA3含量的增加促進(jìn)了果皮淀粉的降解，這與前人的研究結(jié)果一致[5]。本研究還發(fā)現(xiàn)，干旱脅迫可促進(jìn)穎果的ABA的積累，而ABA可以加速籽粒成熟并促進(jìn)貯藏蛋白的積累。

ZR和DHZR是小麥等高等植物體內(nèi)主要的游離態(tài)細(xì)胞分裂素，能促進(jìn)細(xì)胞的分裂和生長。研究表明，禾谷類胚乳細(xì)胞的分裂和擴(kuò)大與籽粒細(xì)胞分裂素的積累有關(guān)[32]。本研究中，干旱脅迫下穎果中的ZR和DHZR含量在發(fā)育早期升高，而發(fā)育后期，兩者含量均低于正常水分處理。另外，干旱脅迫下，發(fā)育早期穎果的胚乳細(xì)胞數(shù)目多，胚乳面積大，表明干旱能誘導(dǎo)穎果中ZR和DHZR含量的增加，促進(jìn)胚乳細(xì)胞的分裂和生長?？偟膩碚f，干旱脅迫會影響小麥穎果中各類激素的積累，而這些激素間相互協(xié)調(diào)，共同調(diào)控胚乳細(xì)胞發(fā)育和充實，使得穎果生長適應(yīng)干旱。