大麥轉錄因子基因 HvNAC1的克隆及功能初探

董 帥，闞金紅，楊 平，馮宗云

(1.四川農業(yè)大學農學院大麥青稞研究中心，四川成都 611130； 2.中國農業(yè)科學院作物科學研究所，北京 100081)

栽培大麥(HordeumvulgareL.)屬于禾本科大麥屬一年生作物，主要用作牲畜的飼料、啤酒釀造以及食品加工的原料等。大麥黃花葉病是我國長江中下游大麥種植區(qū)域的土傳病毒病害，是由大麥黃花葉病毒(Barleyyellowmosaicvirus, BaYMV)和大麥溫和花葉病毒(Barleymildmosaicvirus, BaMMV)兩種不同的RNA病毒感染引起的。這兩種病毒均屬于馬鈴薯Y病毒科大麥黃花葉病毒屬，都含有兩條單鏈RNA基因組序列，編碼2個前體蛋白，翻譯加工后形成十個成熟的功能蛋白[2]。BaYMV/BaYMV病毒株系分類很復雜，在世界各地都發(fā)現(xiàn)了不同的變異類型。目前，共發(fā)現(xiàn)了18個與大麥黃花葉病抗性相關的遺傳位點，其中15個表現(xiàn)為隱性抗性，其余3個(Rym14Hb、Rym16Hb和Rym17)為顯性抗性。rym4和rym5是位于大麥3H染色體長臂(3HL)上的隱性抗性基因，彼此是等位基因，編碼真核生物翻譯起始因子(Eukaryotic translation initiation factor 4E, EIF4E)，其抗病性不同是由氨基酸突變引起的；rym1/11是由蛋白質二硫鍵異構酶基因HvPDIL5-1編碼的隱性抗病基因，由于其基因功能丟失導致抗病性[4-5]。由于病毒寄生于土壤中禾谷多黏菌中，其傳播具有持久性[6]。

NAC類轉錄因子是植物特有的最大轉錄因子家族之一，在很多植物中都有鑒定和研究。目前發(fā)現(xiàn)擬南芥中存在117個NAC轉錄因子，水稻中有151個，煙草和大豆中有152個[7-8]。其由最初發(fā)現(xiàn)的三個基因中都含有保守的NAC結構域得名，這三個基因包括矮牽牛中的NAM(no apical meristem)，擬南芥中的ATAF和CUC2(cup-shaped cytoledon)[9]。其典型特征是在N端有一個大約160個氨基酸組成的高度保守的DNA結合結構域，稱為NAC結構域；C端為轉錄調控區(qū)，其氨基酸序列不保守，可能與參與不同的生物學過程相關。NAC轉錄因子的DNA結合能力主要取決于NAC結構域，NAC結構域可分成5個亞結構域(A-E)。目前，很多研究報道發(fā)現(xiàn)NAC參與植物的多種生命活動過程，包括植物的生長發(fā)育，代謝調控及對生物脅迫或非生物脅迫的響應過程[10]。OsNAC2是水稻中調控分蘗數的相關基因，其過量表達后植株表現(xiàn)分蘗增多的表型，但對腋芽數目沒有影響。SND1與次級纖維壁合成相關，當其表達受抑制時次生壁厚度顯著下降，而過表達之后，大量的次生細胞增生導致次生細胞壁異位沉積使壁明顯加厚。過表達擬南芥ANAC019、ANAC055和ANAC072/RD26，顯著提高植株的抗旱能力[13]。ONAC106過量表達的水稻抗鹽性增強，同時延緩了植株的衰老[14]。水稻中的OsNAC063基因與高鹽脅迫相關，其過量表達可以增強植株耐鹽及滲透高壓的能力。不同的NAC轉錄因子正向或負向調控植物對逆境的耐性。在擬南芥中，AtNAP的插入突變體對鹽脅迫的抗性增強，而過量表達AtNAP則降低對鹽脅迫的抗性，AtNAP主要通過對AREB1的轉錄抑制來實現(xiàn)對鹽脅迫的響應[16]。另外，很多NAC轉錄因子參與植物的抗病過程。在小麥中，TaNAC4和TaNAC8作為轉錄激活因子在植株應對條紋病的過程中起到關鍵作用。水稻中的ONAC122和ONAC131作為正調控因子參與稻瘟病的抗性調控[18]。番茄中的SISRN1同時參與對灰霉菌和丁香假單胞菌的抗性調控[19]。

目前，對大麥中NAC轉錄因子的生物學功能研究很少。大麥HvNAC6通過影響大麥體內脫落酸(abscisic acid, ABA)的積累，參與白粉菌的抗性反應。大麥的脅迫響應基因HvSNAC1(Genbank登錄號JF796130)與水稻的脅迫響應基因SNAC1及小麥的TaNAC2高度同源，過表達HvSNAC1不僅提高了植株對干旱脅迫的耐受性，同時提高對柱隔孢菌葉斑病的抗性反應。大麥的HvNAC1不同于HvSNAC1，因其與擬南芥的AtNAC1序列相似(72.2%)，故命名為HvNAC1(Genbank登錄號AM500855)。先前研究表明HvNAC1受白粉菌侵染后表達上調，沉默HvNAC1基因的表達可以導致植株對白粉菌抗性降低，但是其具體機理未知[20]。本研究通過分析RNA-seq數據，發(fā)現(xiàn)了BaMMV感染之后上調表達的NAC轉錄因子，通過序列相似性比較最終將HORVU5Hr1G011650.1命名為HvNAC1?？寺≡撧D錄因子并初步分析其生物學功能，以期為深入研究其調控機理提供參考。

1 材料與方法

1.1 材 料

本研究所用植物材料為大麥栽培品種Morex和Igri。其中，Morex為北美地區(qū)選育的六棱春大麥，感染BaMMV，其參考基因組序列已經公布[23]，因此以其為材料進行基因的克隆表達分析；Igri為歐洲二棱冬大麥，感染BaMMV，主要用于轉錄組測序分析。本生煙草(Nicotianabenthamiana)用于觀察蛋白的亞細胞定位實驗。

1.2 總RNA的提取和cDNA第一鏈的合成

培養(yǎng)大麥品種Morex至2～4葉期和抽穗期，取整株植物，包括根莖葉以及幼嫩的穗子，分別取樣混勻。液氮冷凍后磨成粉末，采用Trizol法提取其總RNA，并通過逆轉錄得到cDNA，具體操作參照Superscript III cDNA第一鏈合成試劑盒(Invitrogen，美國)說明書。

1.3 大麥 HvNAC1基因的克隆與載體構建

參照大麥HvNAC1(HORVU5 Hr1G011650.1)序列，設計攜帶Gateway克隆位點的特異性引物HvNAC1-attb-F(5′-GGGGACAAGTTTGTAC AAAAAAGCAGGCTTCATATGTCGATGAG CTTCTTGCATG-3′)和HvNAC1-attb-R( 5′-GGGGACCACTTTGTACAAGAAAGCTGGGT CGTGGTTCCAAGTAGAGCTCACTGC-3′)。以大麥總RNA逆轉錄合成的cDNA為模板進行PCR擴增，獲得包含基因全長開放閱讀框在內的序列(HORVU5Hr1G011650.1, BARLEX數據庫，https://apex.ipk-gatersleben.de/apex/f?p=284:10)，反應體系與程序參考phusion polymerase(Thermo，美國)說明書，其中循環(huán)數為35，退火溫度為58 ℃，延伸時間為1 min 30 s。用1.0%瓊脂糖凝膠電泳分離檢測到的PCR產物并切膠回收。具體回收步驟參照普通瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒(天根，北京)說明書。

為獲得后續(xù)研究使用的多個表達載體，采用Gateway的構建方法，高效完成載體構建工作，具體參照Gateway說明書。首先將目的片段克隆到中間載體pDONR207，檢測引物為pDONR207-F(5′-TCGCGTTAACGCTAGCATGG ATCTC-3′)、pDONR207-R (5′-GTAACATCA GAGATTT TGAGACAC-3′)，測序正確的質粒通過重組反應連接到表達載體pGADT7(AD)、pGBKT7(BD)和ppy2(含GFP報告基因)上，其中pGADT7-HvNAC1及pGBKT7-HvNAC1用于酵母雙雜實驗，ppy2-HvNAC1用于檢測農桿菌介導的煙草亞細胞定位。最后獲得ppy2-HvNAC1、pGADT7-HvNAC1和pGBKT7-HvNAC1的質粒備用。

1.4 生物信息學分析

從大麥專業(yè)數據庫BARLEX(http://barlex.barleysequence.org/)中下載大麥基因HORVU5Hr1G011650.1序列及在不同組織部位的表達數據，利用BLASTP (http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast)進行序列同源性搜索，選取相似性較高的五個物種中的NAC轉錄因子進行多序列比對，利用MEGA7 軟件進行進化樹分析，采用鄰接法構建系統(tǒng)進化樹，Bootstrap值為1 000。采用NCBI-CDD(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/cdd/wrpsb.cgi)分析此基因的功能結構域。利用Cell-PLoc 2.0 (http://www.csbio.sjtu.edu.cn/bioinf/Cell-PLoc-2/) 對HvNAC1編碼蛋白的亞細胞定位進行預測分析。利用DP-Bind(http://lcg.rit.albany.edu/dp-bind/)進行DNA結合結構域預測分析，核定位信號在線預測網址為http://mleg.cse.sc.edu/seqNLS。

1.5 亞細胞定位

將ppy2-EV、ppy2-HvNAC1通過凍融法分別轉化到農桿菌GV3101中，涂布于LB+spe (100 μg·mL-1)固體平板上，30 ℃倒置培養(yǎng)。挑取平板上ppy2-HvNAC1、ppy2-EV、P19和pCAMBIA2300-35S -DLT-RFP[24]的單克隆菌落在平板上劃線活化，具體參照Li[25]的方法。注射48 h后在激光掃描共聚焦顯微鏡(Zeiss，德國)下觀察亞細胞定位。

1.6 酵母雙雜實驗

將構建好的pGADT7-HvNAC1利用PEG/LiAc法轉化到Y187菌株中，具體參照Gietz等[26]的方法。pGBKT7-HvNAC1轉化到Y2H Gold菌株中，雙轉pGADT7-HvNAC1+ pGBKT7、pGBKT7-HvNAC1+ pGADT7、pGADT7-T + pGBKT7-53和pGADT7-T + pGBKT7-Lam轉化至Y2H Gold中。挑取SD/-Trp平板上的pGBKT7-HvNAC1單克隆菌落在液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)至OD600約為0.1，依次稀釋成10-2、10-3和10-4共4個濃度梯度，各取2 μL依次點在SD/-Trp/-His和SD/-Ade/-Trp/-His平板上進行轉錄因子活性檢測。挑取雙轉平板上的pGADT7-HvNAC1+ pGBKT7、pGBKT7-HvNAC1+ pGADT7、pGADT7-T + pGBKT7-53和pGADT7-T + pGBKT7-Lam單克隆菌落在液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)至OD600約為0.1，如前所述進行稀釋，點在SD/-Leu/-Trp、SD/-Leu/-Trp/-His和 SD/-Ade/-Leu-/Trp/-His平板上進行自激活檢測。

2 結果與分析

2.1 HvNAC1的生物信息學分析結果

前期結果中，通過對感染BaMMV大麥品種Igri的轉錄組測序的數據分析，發(fā)現(xiàn)HORVU5Hr1G011650.1基因的表達水平顯著上調(圖1)。該基因開放讀碼框全長915 bp，其編碼的蛋白包含304個氨基酸，分子量為33.3 kDa，理論等電點為9.21。保守結構域分析發(fā)現(xiàn)，該蛋白含有1個NAC保守結構域，位于14～141位氨基酸之間，E-value值為2.64E-11，顯示該蛋白屬于NAC轉錄因子家族。序列分析發(fā)現(xiàn)，該基因與注釋為HvNAC1基因(Genbank登錄號AM500855.1)的核苷酸序列相似性達99.56%，氨基酸編碼序列完全相同，證明該基因為HvNAC1。Cell-PLoc 2.0亞細胞定位預測結果顯示此蛋白定位在細胞核中，在NAC結構域中存在一個核定位信號(46～62位氨基酸)和DNA結合結構域(64～140位氨基酸)，暗示HvNAC1具有潛在的轉錄因子功能。通過多序列比對和進化樹分析，發(fā)現(xiàn)HvNAC1蛋白與擬南芥的AtNAC007和小麥的TaNAC7同屬第二亞類，與小麥的TaNAC6A序列相似(圖2)。利用BARLEX工具在線分析HvNAC1基因的組織表達，顯示該基因在大麥的不同生長時期均有表達，在灌漿后期的籽粒以及外穎殼中表達量都較高(圖3)。

誤差棒代表標準誤差；**表示感染組與對照組有極顯著差異(統(tǒng)計分析用t檢驗，P<0.001)。

圖2 HvNAC1與其他物種NAC蛋白的系統(tǒng)進化樹分析

2.2 HvNAC1的亞細胞定位結果

采用農桿菌介導的煙草瞬時表達系統(tǒng)檢測HvNAC1的亞細胞定位。其DLT轉錄因子基因作為陽性對照，定位在細胞核中[24]，其DLT融合的RFP(35S::DLT-RFP)在紅色熒光通道下可看到明顯的細胞核內熒光信號；陰性對照為GFP蛋白(Ubi::GFP)，其綠色熒光信號分布于整個細胞。結果發(fā)現(xiàn)，HvNAC1在細胞核內有綠色熒光信號，與陰性對照在整個細胞中都有綠色熒光信號不同。雙通道疊加實驗結果顯示，HvNAC1在細胞核中出現(xiàn)明亮的黃色，說明HvNAC1和陽性對照DLT存在共定位，均位于細胞核中(圖4)。該實驗結果與亞細胞定位預測結果一致，說明HvNAC1是作為轉錄因子發(fā)揮作用的。

1：幼胚；2：黃化苗；3：苗期根部；4：苗期地上部分；5：第三節(jié)間分蘗；6：幼嫩新生穗；7：新生穗；8：灌漿前期的籽粒；9：灌漿后期的籽粒；10：主穗；11：漿片；12：內稃；13：外穎殼；14：穗軸；15：灌漿期根部；16：衰老葉。圖柱上的字母不同表示組織之間的差異顯著(P<0.05，單因素方差分析)。

圖4 HvNAC1的亞細胞定位

2.3 HvNAC1的轉錄因子功能研究

根據含BD-HvNAC1的Y2HGold菌株在篩選培養(yǎng)基上的生長情況，可以檢測HvNAC1的轉錄因子活性。與陽性對照AD-T+BD-53的生長情況相似，含有BD-HvNAC1的Y2HGold在SD/-Trp、SD/-Trp/-His和SD/-Trp/-His/-Ade三種培養(yǎng)基上均能正常生長，含空載體BD(負對照)的Y2HGold菌株僅在SD/-Trp上正常生長，在SD/-Trp/-His和SD/-Trp/-His/-Ade上不生長(圖5)。該結果表明在酵母系統(tǒng)中HvNAC1有轉錄因子激活活性。

為檢測HvNAC1是否具有自激活活性，分別構建AD-HvNAC1和BD-HvNAC1，并轉化Y2HGold酵母菌株。陽性對照(AD-T+BD-53)在三缺和四缺培養(yǎng)基上可正常生長，而陰性對照(AD-T+BD-Lam)不能生長。雙轉AD+BD-HvNAC1在三缺和四缺培養(yǎng)基上均正常生長(圖6)，說明HvNAC1具有轉錄因子激活活性，與單轉的結果(圖5)相同。雙轉AD-HvNAC1+BD的酵母菌株在三缺和四缺培養(yǎng)基上不生長，說明HvNAC1沒有自激活活性，可用于篩選與之互作的目標蛋白。

綜上，HvNAC1具有轉錄因子激活活性，亞細胞定位實驗結果也揭示其定位在細胞核中，因此，我們猜測HvNAC1作為轉錄因子，可能參與調控大麥黃花葉病毒感染的相關基因。

圖5 HvNAC1的轉錄因子活性

圖6 HvNAC1的自激活檢測

3 討 論

NAC類轉錄因子作為一個轉錄因子超級家族，參與植株的生長、發(fā)育、代謝等過程，也與植物的逆境響應有關。本研究通過分析轉錄組測序結果和利用基因克隆的手段，獲得了BaMMV感染之后表達上調的大麥轉錄因子HvNAC1，該基因具有NAC轉錄因子家族特有的NAC結構域、典型的核定位信號序列和DNA結合結構域。通過進化樹分析物種間的序列變異發(fā)現(xiàn)，該基因與小麥的TaNAC6A同源性最高。組織表達分析表明，HvNAC1在植物各個組織中都有一定的表達，但在后期灌漿籽粒中表達量最高，預測該基因可能具有一因多效，可能也參與到種子的發(fā)育過程中。有意思的是，HvNAC1在苗期根部和地上部分正常表達，BaMMV感染會導致該基因的表達量極顯著上調，說明大麥黃花葉病的感染與HvNAC1的上調表達相關，該基因可能參與大麥黃花葉病的感染過程。先前的研究表明，HvNAC6可以通過影響脫落酸的積累正向調控白粉菌的抗性反應[20]，說明植物激素參與NAC轉錄因子的信號轉導。因而我們猜測，HvNAC1的差異表達可能會誘導激素(比如抗病相關植物激素水楊酸、茉莉酸或者乙烯等)信號途徑，從而影響大麥黃花葉病的感染過程。

基于亞細胞定位實驗結果，HvNAC1編碼蛋白位于細胞核內，與生物信息學預測和先前報道的典型NAC轉錄因子蛋白的亞細胞定位相同。與之對應的是，酵母實驗結果進一步證實，該蛋白具有轉錄因子活性，推測HvNAC1具有調控基因表達的生物學功能，可能參與調控大麥黃花葉病相關基因的表達，從而輔助完成病毒感染。例如，在煙草花葉病毒(Tobaccomosaicvirus, TMV)感染擬南芥的過程中，NAC轉錄因子ATAF2表達上調，并正向調控防御相關基因PR1，PR2和PDF1.2的表達，從而提高植物的抗性反應，降低病毒的積累[27]。因此，本研究結果為后續(xù)深入研究染色質免疫共沉淀以及HvNAC1的靶標位點墊定了基礎。

此外，NAC轉錄因子可以通過與相關蛋白直接互作，或者通過泛素介導的蛋白降解途徑，二聚化或者蛋白的修飾完成NAC生物學功能[28]。例如大麥中與衰老相關的NAC轉錄因子HvNAC013通過C端轉錄調控結構域與RCD1(radical-induced cell death 1)蛋白互作，從而調控衰老過程[29]。擬南芥的SnRK1(SNF1-related protein kinase)的催化亞基與NAC轉錄因子ATAF1相互作用，并使其發(fā)生磷酸化，調控ATAF1的亞細胞定位、DNA結合活性等；同時SnRK1與E3-泛素連接酶的互作促使與SnRK1互作的ATAF1被蛋白酶體降解途徑靶向并降解，從而調控植物的脅迫響應和葡萄糖的信號轉導[9]。未發(fā)表實驗結果表明，酵母雙雜實驗未檢測到HvNAC1與大麥黃花葉病隱性抗病基因HvEIF4E和HvPDIL5-1的蛋白互作，暗示HvNAC1參與病毒感染可能不是通過與感病基因的物理互作實現(xiàn)的，但是該結果不能排除HvNAC1與感病通路中其他蛋白存在物理互作。本研究發(fā)現(xiàn)HvNAC1在酵母系統(tǒng)的AD載體上不具有自激活活性，因此可以用于鑒定該編碼蛋白的互作因子，為后續(xù)研究其調控模式提供了工具。